臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)主管技師考試輔導(dǎo)86

1、最新修正版第十四章 免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測(cè)技術(shù)第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離第二節(jié)淋巴細(xì)胞標(biāo)志及亞群分類第三節(jié)其他的免疫細(xì)胞第四節(jié) 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)及應(yīng)用第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離一、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離將2份6%聚蔗糖蒸餾水溶液與 1份34%乏影葡胺生理鹽水溶液混合，其比重為1.077 ± 0.002，可作為常規(guī)的淋巴細(xì)胞分離液，即Ficoll 分離液。'申單次密度梯度離心分離法，其分布由上到下依次為：的血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層。稀釋二、淋巴細(xì)胞的分離純淋巴細(xì)胞群的采集是利用單核細(xì)胞在37C和CaT存在時(shí)，能主動(dòng)黏附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠

2、的特性，從單個(gè)核細(xì)胞懸液中除去單核細(xì)胞，從而獲得純淋巴細(xì)胞群。1. 黏附貼壁法2. 吸附柱過(guò)濾法3. 磁鐵吸引法4. P ercoll 分離液法三、T細(xì)胞和B細(xì)胞的分離1. E花環(huán)沉降法2. 尼龍毛柱分離法四、T細(xì)胞亞群的分離1. 親和板結(jié)合分離法2. 磁性微球分離法3. 熒光激活細(xì)胞分離儀分離法五、分離細(xì)胞的保存1. 短期保存技術(shù)將分離的細(xì)胞用適量含 短期保存可置于 4C保存。2. 長(zhǎng)期保存技術(shù)液氮深低溫（-196 C）10%- 20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。環(huán)境保存細(xì)胞，加入二甲亞砜作為保護(hù)劑。六、分離細(xì)胞的活力測(cè)定活力測(cè)定最簡(jiǎn)便常用的

3、為臺(tái)盼藍(lán)染色法。這種染料不能透過(guò)活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，可使染料通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈藍(lán)色，通過(guò)死亡細(xì)胞與活細(xì)胞的百分比可反映細(xì)胞活力。七、不同細(xì)胞分離方法的綜合評(píng)價(jià)早期的免疫細(xì)胞分離技術(shù)主要是根據(jù)不同免疫細(xì)胞的物理屬性（如比重不同）和生物學(xué)屬性（如黏附 力不同）進(jìn)行分離，用目前的標(biāo)準(zhǔn)看，其分離的靈敏度或分辨率都不高。作為一種傳統(tǒng)的分離手段其分離 效果已被認(rèn)可，如用單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行的某些實(shí)驗(yàn)，一般被認(rèn)為可以代表淋巴細(xì)胞，無(wú)特別需要一般并不采 用分離純化淋巴細(xì)胞的替代技術(shù)。作為富集某一類細(xì)胞的手段，傳統(tǒng)的方法仍不失為簡(jiǎn)便和行之有效的技 術(shù)

4、，而且傳統(tǒng)，如 P ercoll連續(xù)密度離心法仍可得到非常理想的細(xì)胞分離效果，但P ercoll法分離流程長(zhǎng),手續(xù)繁多，若無(wú)特殊需要很少采用。傳統(tǒng)的細(xì)胞分離技術(shù)主要采用離心法，利用密度梯度原理進(jìn)行分離，時(shí)間長(zhǎng)、效果差。近期發(fā)展起來(lái) 的細(xì)胞分離技術(shù)大多是基于利用細(xì)胞表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行細(xì)胞分離，較早出現(xiàn)的技術(shù)以細(xì)胞親和 層析為代表。隨后出現(xiàn)細(xì)胞固相包被技術(shù)，細(xì)胞淘洗技術(shù)，同時(shí)還有流式細(xì)胞儀分離技術(shù)，磁性微球分離 法。這些技術(shù)的出現(xiàn)使細(xì)胞分離技術(shù)產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)步。目前這類技術(shù)主要用于科研，在常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn) 室中并未廣泛應(yīng)用。另外這類技術(shù)所依賴的設(shè)備和試劑價(jià)格昂貴，目前尚不能完全替代經(jīng)典的細(xì)胞

5、分離技 術(shù)。第二節(jié)淋巴細(xì)胞標(biāo)志及亞群分類一、T細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群所有的T細(xì)胞均有共同的標(biāo)志性抗原，一般認(rèn)為是CD3Cd3 Cd4CD8輔助性T細(xì)胞（Th）CD3CD4CD8細(xì)胞毒性 T細(xì)胞（Tc或CTL）Cd4 CD25 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tr或Treg ）CD2表達(dá)于全部人 T細(xì)胞和NK細(xì)胞表面，因其能與綿羊紅細(xì)胞（SRBC結(jié)合，又稱為綿羊紅細(xì)胞受體。CD3是一種多鏈的糖蛋白，表達(dá)于全部T細(xì)胞表面，是T細(xì)胞的表面標(biāo)志，是 TCR-CD3復(fù)合物的重要組成部分。CD4/ CD8 CD4和 CD8分子分別表達(dá)于外周血不同的T細(xì)胞亞群表面，是區(qū)分 T細(xì)胞亞群的重要標(biāo)志。表達(dá)CD4的主要是輔助性 T細(xì)胞

6、，表達(dá)CD8的主要是細(xì)胞毒性 T細(xì)胞。其他表面標(biāo)志：致有絲分裂受體、 病毒受體。（一）輔助性T細(xì)胞輔助性T細(xì)胞的典型表面標(biāo)志是 Cd3 Cd4CD8。已證明不同的輔助性 T細(xì)胞株所產(chǎn)生的細(xì)胞因子不盡 相同，因而認(rèn)為體內(nèi)至少存在兩種輔助性T細(xì)胞（Th1, Th2）。研究表明，Th1主要分泌IL-2、IFN- 丫或TNF-3等細(xì)胞因子輔助細(xì)胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)，本身具有明顯的細(xì)胞毒作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等細(xì)胞因子輔助體液免疫，參與速發(fā)型超敏反應(yīng)，但本身不具有明顯的細(xì)胞毒作用。（二）細(xì)胞毒性T細(xì)胞細(xì)胞毒性T細(xì)胞的典型表面標(biāo)志是 Cd3 CD4 Cd8。與輔

7、助性T細(xì)胞類似，細(xì)胞毒性 T細(xì)胞也可以分泌 細(xì)胞因子，而且不同的細(xì)胞株所產(chǎn)生的細(xì)胞因子也不盡相同，分泌細(xì)胞因子的特征與Th1和Th2十分相似，遂將細(xì)胞毒性T細(xì)胞再細(xì)分為 Tc1與Tc2, Tc1與Tc2都有典型的細(xì)胞毒性效應(yīng)。（三）調(diào)節(jié)性T細(xì)胞目前認(rèn)為調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞主要包括兩個(gè)亞群，一種是CD4CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；另一種為 CD8調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其主要包括 CD8CD28調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD8 Qa-1限制性的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞。二、B細(xì)胞表面標(biāo)志B細(xì)胞表面的膜免疫球蛋白（ Smig）、Fc受體、補(bǔ)體受體、EB病毒受體和小鼠紅細(xì)胞受體是B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志。膜免疫球蛋白（mig）又稱為BCR表達(dá)于所

8、有成熟的 B細(xì)胞和大多數(shù) B細(xì)胞瘤的細(xì)胞表面，屬于免疫 球蛋白超家族原型，是 B纟田胞最具特性的表面標(biāo)志。mIg的主要作用是結(jié)合特異性抗原，故又稱為抗原受體。成熟B細(xì)胞的mig主要為mIgM和mIgDbB細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫調(diào)節(jié)紊亂的重要指標(biāo)。三、NK細(xì)胞表面標(biāo)志人類NK細(xì)胞表面標(biāo)志： CD16 CD56CD16分子又稱為低親和性IgG Fc受體，當(dāng)IgG類抗體與靶細(xì)胞表面相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合后，可通 過(guò)其Fc段與NK細(xì)胞表面FcRin結(jié)合，行使針對(duì)靶細(xì)胞的定向非特異性殺傷作用，也即NK細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC。第三節(jié)其他的免疫細(xì)胞其他的免

9、疫細(xì)胞包括髓系細(xì)胞，如單核-巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞等，特別是抗原提呈細(xì)胞尤為重要?？乖岢始?xì)胞（APC指能攝取、加工、處理抗原，并將抗原提呈給抗原特異性淋巴細(xì)胞的一類免疫細(xì) 胞?？乖岢始?xì)胞可分為兩類： “專職”抗原提呈細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞，它們均可表達(dá) MHC衛(wèi)類分子。 “非專職”抗原提呈細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和激活T細(xì)胞等，它們?cè)谀承┮蛩卮碳は驴杀磉_(dá)MHC-n類分子，并具有抗原提呈功能。所有表達(dá)MHC-I類分子并具有提呈內(nèi)源性抗原能力的細(xì)胞，廣義上也屬于抗原提呈細(xì)胞。一、單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS包括骨髓內(nèi)的前單核細(xì)胞、外周血中的單核細(xì)胞和組織內(nèi)的

10、巨噬細(xì)胞。 單核-吞噬細(xì)胞的典型的表面標(biāo)志是 CD14二、樹(shù)突狀細(xì)胞髓系和淋巴系。Th1的DC（ DC1和誘導(dǎo)分化 Th2樹(shù)突狀細(xì)胞（DC是一大類專職抗原提呈細(xì)胞，其主要有兩種來(lái)源，即 DC是形態(tài)、表型和功能高度異質(zhì)的細(xì)胞。根據(jù)刺激T細(xì)胞增殖能力的不同，它們被分為成熟和不成熟的DC根據(jù)誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為不同效應(yīng) T細(xì)胞的功能，將它們分為誘導(dǎo)分化 的 DC（DC2 。根據(jù)明顯的譜系和細(xì)胞表型的不同，分為髓系DC和淋巴DC人成熟DC的主要特征表面標(biāo)志為 CD1a CD11C和CD83第四節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)及應(yīng)用一、免疫細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)方法（一）抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法（二）免疫細(xì)胞化學(xué)法通常以酶作

11、為抗體標(biāo)志物，采用細(xì)胞酶免疫組織化學(xué)技術(shù)完成（詳見(jiàn)第十三章），并常采用生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)提高靈敏度。該類方法可用普通顯微鏡觀察，凡著色的細(xì)胞即為相應(yīng) CD抗原陽(yáng)性的細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率進(jìn)行定量分析。本法簡(jiǎn)便易行，不需特殊儀器，一般實(shí)驗(yàn)室均可采用。（三）免疫熒光法本法是將分離得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞與相應(yīng)的以熒光素標(biāo)記的CD單克隆抗體作用（直接法），或與抗相應(yīng)CD單克隆抗體作用后，洗去游離的抗體，再加入熒光素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗血清，經(jīng)溫育結(jié)合后，洗去多余的標(biāo)記抗體（間接法），制片后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率。（四）流式細(xì)胞分析法目前免疫細(xì)胞的

12、檢測(cè)主要采用流式細(xì)胞術(shù)，結(jié)果客觀準(zhǔn)確，重復(fù)性好。二、淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)的臨床意義淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)是評(píng)價(jià)免疫功能的重要指標(biāo)。由于淋巴細(xì)胞，特別是T淋巴細(xì)胞在執(zhí)行免疫功能方面發(fā)揮多種作用，故有必要對(duì)各類淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞亞群）進(jìn)行分析。這中間主要是通過(guò)表面標(biāo)志 識(shí)別進(jìn)行計(jì)數(shù)。在評(píng)價(jià)免疫功能時(shí)經(jīng)常采用CD4/ CD8比值。如CD4是HIV受體，HIV感染時(shí)CD4/CD8比值明顯降低。但CD4陽(yáng)性細(xì)胞包括了很多功能性細(xì)胞，如TH Tr等，CD8陽(yáng)性細(xì)胞也是如此，所以單用CD4/ CD8比值反映免疫功能顯然不夠準(zhǔn)確。除AIDS患者外，實(shí)際觀察 CD4/ CD8比值與患者的免疫功能及臨床癥狀的關(guān)系及意義有限。對(duì)CD4和CD8T細(xì)胞的測(cè)定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測(cè)。CD4/CD8升高常見(jiàn)于自身免疫性疾??；而CD4/ CD8降低常見(jiàn)于病毒感染、惡性腫瘤和再生障礙性貧血等。在使用淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)資料時(shí)應(yīng)特別注意淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)所采用的方法，因?yàn)椴煌姆椒ㄋ玫降慕Y(jié)果差 別很大，特別是目前對(duì)淋巴細(xì)胞檢測(cè)方面尚無(wú)高水平的質(zhì)控以及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，所以不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果可 比性差。標(biāo)本處理方法不同、實(shí)驗(yàn)條