便秘大鼠腸壁內(nèi)一氧化氮合酶表達(dá)和腸嗜鉻細(xì)胞改變的可復(fù)性研究

1、便秘大鼠腸壁內(nèi)一氧化氮合酶表達(dá)和腸嗜鉻細(xì)胞改變的可復(fù)性研究                作者：趙士彭 桂林 卞紅磊 張燕 趙發(fā) 王瑩【摘要】  目的 觀察便秘模型大鼠回腸和結(jié)腸一氧化氮合酶和腸嗜鉻細(xì)胞的變化及自然恢復(fù)情況，了解大黃所致便秘的可恢復(fù)性。方法 Wistar大鼠60只，按照完全隨機(jī)的方法分為便秘組、恢復(fù)組、對(duì)照組，便秘組和恢復(fù)組給予大黃建立便秘大鼠模型，恢復(fù)組于建立模型完成后任其自然恢復(fù)6周。以放射免疫方法和免疫組織化學(xué)方法測(cè)定比較各

2、組大鼠回腸和結(jié)腸一氧化氮合酶和腸嗜鉻細(xì)胞的變化。結(jié)果 便秘組和恢復(fù)組大鼠的回腸、結(jié)腸NOS含量均明顯升高（P0.05）,恢復(fù)組回腸NOS含量明顯低于便秘組（P0.05），恢復(fù)組結(jié)腸NOS含量與便秘組比較無差別（P0.05）。便秘組大鼠腸道5-HT免疫反應(yīng)陽性的腸嗜鉻細(xì)胞密度高于對(duì)照組，(回腸、橫結(jié)腸P0.05)?；謴?fù)組大鼠腸道5-HT免疫反應(yīng)陽性的腸嗜鉻細(xì)胞密度低于便秘組(回腸、橫結(jié)腸P0.05)但高于對(duì)照組 (回腸、橫結(jié)腸P0.05)。結(jié)論 長(zhǎng)期應(yīng)用大黃等蒽醌類瀉劑對(duì)腸道神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的損害作用，回腸和結(jié)腸NOS含量和腸嗜鉻細(xì)胞密度升高，停用大黃恢復(fù)性飼養(yǎng)6周后腸道神經(jīng)遞質(zhì)部分恢復(fù)。 【關(guān)鍵

3、詞】  一氧化氮合酶;腸嗜鉻細(xì)胞;便秘;結(jié)腸   Alteration and recovery of nitricoxide synthase and enterochromaffin cell expression in the intestinal wall of constipation model rats   Abstract  Objective  This study was designed to evaluate the changes of nitricoxide synthase (NOS) and

4、enterochromaffin cell (EC) in the ileum and colon of constipated Wister rats and to observe the possibility of natural recovery. Methods  Sixty healthy Wister rats were divided randomly into control group, constipation group and recovery group. In constipation group and recovery group, the rats

5、 were administered leachate of rhubarb to make constipation model. The recovery group was recovered naturally for six weeks. NOS and EC in the ileum and colon were detected by the method of immunohistochemical stain and radioimmunoassay and compared in the three groups. Results NOS expression in the

6、 constipation group and recovery group were significantly higher than that in the control group both in the ileum and in the colon (P0.05). Compared with constipation group, the NOS expression in the recovery group was decreased in the ileum (P0.05) and had no alternation in the colon (P0.05). Compa

7、red with control group, enterochromaffin cell density in the constipation group and recovery group was increased both in the ileum and colon (P0.05). enterochromaffin cell density in the recovery group is lower than that in the constipation group both in the ileum and colon(P0.05). Conclusion 

8、Long-term administeration of rhubarb can do harm to the enteric nervous system through changing NOS and EC. Six weeks after stopping the administeration of rhubarb, NOS expression and EC density partly recover.   Key words  Nitricoxide synthase (NOS); Enterochromaffin cell (EC); Const

9、ipation; Colon   慢傳輸型便秘（slow transit constipation， STC）是臨床上常見的一類以結(jié)腸動(dòng)力減弱為主要特點(diǎn)的頑固性便秘。其病因、發(fā)病機(jī)制、藥物治療機(jī)制尚未完全清楚。張連陽等應(yīng)用大黃成功建立慢傳輸型便秘大鼠模型，為研究瀉劑對(duì)胃腸道的影響提供了可靠工具。   腸神經(jīng)系統(tǒng)損傷與慢傳輸型便秘的關(guān)系密切，本研究課題在大鼠瀉劑結(jié)腸模型建立后，進(jìn)行恢復(fù)性飼養(yǎng)，通過觀察便秘大鼠回腸和橫結(jié)腸一氧化氮合酶（NOS）和腸嗜鉻細(xì)胞的變化和停用瀉劑后的恢復(fù)情況，了解腸神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的可逆轉(zhuǎn)性。   1 

10、材料與方法   1.1  動(dòng)物分組  健康Wistar大鼠60只，雌性，體重(200±30)g，由河北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（合格證編號(hào)：DK0510071），按照完全隨機(jī)的方法分為便秘組、恢復(fù)組和對(duì)照組，各20只，分組后各組間體質(zhì)量、性別無顯著性差異。   1.2  動(dòng)物處理  大鼠分籠飼養(yǎng)，保持適宜的環(huán)境(溫度1625；相對(duì)濕度50%70%，清潔安靜)。飼以普通級(jí)顆粒飼料，由河北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心配制（合格證編號(hào)：WK0510024）。飼養(yǎng)一周后開始建立模型，便秘組及恢復(fù)組采用大黃浸液灌胃，每日1次，大黃浸液

11、提取方法：大黃生粉加15倍沸水，恒溫浸泡30 min后過濾，灌胃前加溫到30。首日劑量為800 mg/kg(生粉)，此后每日劑量增加200 mg/kg(生粉)，直至出現(xiàn)半數(shù)大鼠糞便變稀，保持劑量至80%的稀便消失,繼續(xù)加量給藥，至又有半數(shù)大鼠糞便變稀，如此程序循環(huán)3次，待實(shí)驗(yàn)組第三次80%的稀便消失1周后，采用活性炭灌胃法測(cè)定首粒黑便排出時(shí)間：大鼠禁食24 h，經(jīng)口灌入100 g/L活性炭懸液2 mL，從活性炭灌胃完畢開始記時(shí)，記錄從灌胃到首粒黑便排出的時(shí)間，證實(shí)首粒黑便排出時(shí)間顯著延長(zhǎng)，腸道傳輸速度明顯減慢，停止建模，便秘組繼續(xù)飼養(yǎng)一周后與對(duì)照組同時(shí)取材，恢復(fù)組以同等體積蒸餾水灌胃恢復(fù)喂養(yǎng)，

12、時(shí)間為周。飼養(yǎng)過程中對(duì)照組大鼠只死亡，恢復(fù)組死亡只，具體原因不明。   1.3  取材及標(biāo)本處理  乙醚麻醉，通過腹部正中切口暴露腹腔，迅速切取距回盲瓣5 cm處回腸及橫結(jié)腸組織,長(zhǎng)約2 cm，生理鹽水沖去腸內(nèi)容物以及黏膜表面粘附的糞便、分泌物及血液，部分組織多聚甲醛固定，石臘包埋。將包埋好的組織塊連續(xù)切片，厚度為5 m，分別裱于載玻片上，37溫箱內(nèi)干燥24 h，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。部分組織加入0.9%生理鹽水中煮沸10 min，冷卻后置入電動(dòng)勻漿器中,加入1 mol/L乙酸后, 充分勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)入塑料試管中,過夜,加入等體積的1 mol/L氫氧化

13、鈉溶液,按3000 r/min離心15 min,取上清液,-20保存。用放射免疫法測(cè)定NOS含量。   1.4  免疫組織化學(xué)染色   1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  所有數(shù)據(jù)以mean±s表示，應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行ANOVA方差分析，P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。            2  結(jié)  果   2.1  便秘大鼠回腸和結(jié)腸NOS含量  用放

14、射免疫法測(cè)定NOS含量，與對(duì)照組相比，便秘組和恢復(fù)組大鼠的回腸、結(jié)腸NOS含量均明顯升高（分別P0.05）,恢復(fù)組回腸NOS含量明顯低于便秘組（P0.05）,但恢復(fù)組結(jié)腸NOS含量與便秘組比較無明顯變化(P0.05)(表1)。表1  各組大鼠回腸和橫結(jié)腸NOS(x±s)含量和每高倍鏡視野(200倍)腸嗜鉻細(xì)胞數(shù)比較（略） 注：*與對(duì)照組比較P0.05；#與便秘組比較P0.05   2.2  腸嗜鉻細(xì)胞染色  便秘組、恢復(fù)組及對(duì)照組大鼠回腸、橫結(jié)腸切片的黏膜層均可見5羥色胺（5-HT）免疫反應(yīng)陽性的腸嗜鉻細(xì)胞，胞質(zhì)和胞突中有棕色或棕黑色

15、顆粒，核藍(lán)色,背景淡黃色，對(duì)比鮮明，腸嗜鉻細(xì)胞形態(tài)多樣，呈錐體形、梭形、圓形、橢圓形、桿形等，胞突長(zhǎng)短不一,部分細(xì)胞發(fā)出突起伸向腺腔或黏膜固有層。便秘組大鼠腸道5-HT免疫反應(yīng)陽性的腸嗜鉻細(xì)胞密度高于對(duì)照組，(回腸、橫結(jié)腸P0.05)?；謴?fù)組大鼠腸道5-HT免疫反應(yīng)陽性的腸嗜鉻細(xì)胞密度低于便秘組(回腸、橫結(jié)腸P0.05)但高于對(duì)照組 (回腸、橫結(jié)腸P0.05)(表1) 。   3  討  論   結(jié)腸慢傳輸性便秘是因結(jié)腸傳輸功能減弱致使腸內(nèi)容物滯留于結(jié)腸而引起的頑固性便秘，病因不清，部分患者可能是濫用瀉劑所致。Bassotti等1行小

16、腸測(cè)壓證實(shí)，結(jié)腸慢傳輸性便秘患者的小腸存在異常動(dòng)力模式，包括強(qiáng)烈的不協(xié)調(diào)收縮和散發(fā)性束狀收縮，但作用機(jī)制尚不清楚。其它研究也發(fā)現(xiàn)，部分結(jié)腸慢傳輸性便秘患者存在全胃腸道動(dòng)力異常，如膽囊、胃排空及小腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能減慢,腸神經(jīng)系統(tǒng)異常與慢傳輸型便秘有關(guān)2。   一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種氣體信使分子，具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性。許多研究結(jié)果確認(rèn)NO是胃腸道NANC神經(jīng)所釋放的主要抑制性遞質(zhì)，抑制胃腸運(yùn)動(dòng)。一氧化氮合酶(NOS)是內(nèi)源性NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶， NOS廣泛存在于從食管到肛門內(nèi)括約肌的胃腸道組織內(nèi)，說明NO在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)中的重要性。離體實(shí)驗(yàn)中，觀察到大

17、鼠小腸和橫結(jié)腸蠕動(dòng)反射中的下行抑制成分和食物進(jìn)入豚鼠胃內(nèi)引起的胃底舒張和胃容積增大，是由NANC神經(jīng)釋放的NO介導(dǎo)。目前對(duì)NO的病理生理作用還不太清楚，但可以推測(cè)，產(chǎn)生NO的神經(jīng)密度、NO釋放過程、或平滑肌對(duì)內(nèi)源性NO的敏感性發(fā)生變化時(shí)，都可以使神經(jīng)肌肉的功能異常，使正常的興奮性和抑制性神經(jīng)活動(dòng)失去平衡，有效的推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)減少，從而導(dǎo)致胃腸道運(yùn)動(dòng)異常。   本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示恢復(fù)組和便秘組回腸及結(jié)腸腸壁組織NOS含量較對(duì)照組明顯增高（分別P0.05），恢復(fù)組回腸NOS含量明顯低于便秘組（P0.05）,但恢復(fù)組結(jié)腸NOS含量較便秘組降低，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明長(zhǎng)期應(yīng)用大黃等蒽醌類

18、瀉劑對(duì)腸道神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的損害作用，或者是擾亂了腸道神經(jīng)遞質(zhì)分泌的平衡狀態(tài)，引起胃腸道NO的產(chǎn)生增多，但這種損害作用是可逆的，停用瀉劑后回腸腸壁NOS恢復(fù)性下降較快，但結(jié)腸腸壁神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)較慢，能否在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)恢復(fù)正常狀態(tài)有待進(jìn)一步研究。   腸嗜鉻細(xì)胞(EC)存在于胃腸道黏膜層，合成并儲(chǔ)存機(jī)體大部分5-HT，腸嗜鉻細(xì)胞釋放的5-HT通過與相關(guān)受體結(jié)合，調(diào)控胃腸道感覺、分泌及運(yùn)動(dòng)功能。具體作用方式有以下三種：直接作用于上皮細(xì)胞或平滑肌產(chǎn)生分泌及運(yùn)動(dòng)作用于內(nèi)源性傳入神經(jīng)（IPANs）及中間神經(jīng)元，產(chǎn)生并調(diào)節(jié)分泌、蠕動(dòng)反射：腸嗜鉻細(xì)胞釋放的5-HT通過5-HT1P受體激活黏膜

19、下IPANs，黏膜下IPANs在釋放乙酰膽堿(Ach)的同時(shí)釋放降鈣素基因相關(guān)肽3，進(jìn)而通過不同的神經(jīng)遞質(zhì)如VIP、NO等興奮或抑制胃腸道運(yùn)動(dòng)及分泌。作用于外源性傳入神經(jīng)突觸后膜上的5-HT3 受體，將感覺信號(hào)傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)4。其中腸嗜鉻細(xì)胞釋放的5-HT是胃腸道運(yùn)動(dòng)及分泌的始動(dòng)因素。腸嗜鉻細(xì)胞在腸易激綜合征患者的腸道黏膜中有改變并參與了內(nèi)臟感覺過敏的發(fā)生5,6，但在大黃所致便秘中的作用卻未見報(bào)道。   本研究在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠腸道所有切片的黏膜層中均可見5-HT免疫反應(yīng)陽性的腸嗜鉻細(xì)胞，胞質(zhì)和胞突中有棕色或棕黑色顆粒，核呈藍(lán)色,背景呈淡黃色，對(duì)比鮮明。便秘組大鼠回

20、腸、橫結(jié)腸5-HT免疫反應(yīng)陽性的腸嗜鉻細(xì)胞密度高于對(duì)照組(P0.05)?；謴?fù)組大鼠回腸、橫結(jié)腸5-HT免疫反應(yīng)陽性的腸嗜鉻細(xì)胞密度低于便秘組(P0.05)，但高于對(duì)照組 (P0.05)。分析其原因可能在建模階段，逐漸增加的大黃破壞了腸嗜鉻細(xì)胞的釋放平衡，導(dǎo)致大量5-HT進(jìn)入腺腔和黏膜固有層，促進(jìn)了胃腸道運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生腹瀉，此時(shí)腸嗜鉻細(xì)胞內(nèi)5-HT含量減少，隨著大黃改為維持劑量，腸嗜鉻細(xì)胞逐漸耐受刺激，5-HT釋放減少，合成及重?cái)z取增多，細(xì)胞內(nèi)5-HT含量增加，顆粒增多，較多細(xì)胞能被檢出。與此同時(shí)，黏膜下叢IPANs、平滑肌以及分泌細(xì)胞在前階段超量5-HT作用下，出現(xiàn)受體脫敏，對(duì)5-HT效應(yīng)性下降，

21、致使腸道運(yùn)動(dòng)減弱，分泌減少，稀便消失。藥物繼續(xù)加量時(shí)，再次破壞了5-HT的釋放平衡，形成上述循環(huán)。上述原因造成建模后腸嗜鉻細(xì)胞對(duì)大黃刺激出現(xiàn)耐受，5-HT釋放減少，不足以維持胃腸道正常運(yùn)動(dòng)及分泌，此時(shí)免疫反應(yīng)陽性的腸嗜鉻細(xì)胞密度升高，恢復(fù)期大鼠在停藥后腸嗜鉻細(xì)胞的耐受性逐漸恢復(fù)，5-HT釋放增加，腸嗜鉻細(xì)胞內(nèi)5-HT含量減少，有些細(xì)胞未能用免疫組化方法檢出,檢出的細(xì)胞著色淺淡,5-HT免疫反應(yīng)陽性的腸嗜鉻細(xì)胞密度降低。   大黃所致便秘大鼠腸壁組織腸嗜鉻細(xì)胞及NOS的變化如何影響小腸的功能，目前研究較少。本試驗(yàn)僅研究了瀉劑致大鼠便秘后腸嗜鉻細(xì)胞和NOS的變化及其在造模后6周的恢復(fù)情況，對(duì)于瀉劑致便秘的整個(gè)病理過程及胃腸道其它神經(jīng)遞質(zhì)的變化有待深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 周呂，柯美云主編.胃腸動(dòng)力學(xué)一基礎(chǔ)與臨床M.北京：科學(xué)出版社，1999：227-245.2 Bian XC, Heffer LF, Gwynne