臨床酵母樣真菌快速鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)方法的研究

1、臨床酵母樣真菌快速鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)方法的研究【關(guān)鍵詞】 臨床 摘 要 目的：建立一種臨床酵母樣真菌快速鑒定和藥敏試驗(yàn)方法。方法：采用珠海麗拓公司生產(chǎn)的真菌分離鑒定檢測(cè)試劑盒，對(duì)臨床感染真菌標(biāo)本和酵母樣真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行鑒定，并與法國(guó)梅里埃真菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)照。 結(jié)果：6株酵母樣真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株鑒定符合率為100，115株臨床標(biāo)本兩種試劑鑒定符合率為92.55，藥敏結(jié)果顯示臨床標(biāo)本對(duì)咪唑類抗真菌藥物出現(xiàn)較高的耐藥性，值得臨床重視。結(jié)論：本研究所采用方法操作簡(jiǎn)便，特異性較好，便于臨床酵母樣真菌標(biāo)本的常規(guī)鑒定。 關(guān)鍵詞 酵母樣真菌；快速鑒定；藥敏試驗(yàn) 在臨床上，由于廣泛使用抗生素、免疫抑制藥物及開(kāi)展移植手術(shù)

2、等因素，致使真菌感染越來(lái)越多。而各種抗真菌藥物的濫用，更加劇了真菌感染的復(fù)發(fā)和增加了治療的難度。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)造成真菌感染的大部分是酵母樣真菌。因此，對(duì)臨床上建立快速酵母樣真菌分離培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)顯得尤為重要1。目前，臨床真菌分離培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)大多分開(kāi)進(jìn)行，要花較多的時(shí)間和人力物力，影響臨床診斷。為此，筆者對(duì)酵母樣真菌的快速分離培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行的方法學(xué)進(jìn)行了探討研究，報(bào)告如下。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 共6株分別是：白色念珠菌1株（編號(hào)為CMIDC.1c），熱帶念珠菌1株（編號(hào)為CMIDC.2a），光滑念珠菌1株（編號(hào)為CMIDY.10）

3、，克柔念珠菌1株（編號(hào)為CMIDY.6c），季爾蒙念珠菌（編號(hào)為CMIDC.5b），新生隱球菌（編號(hào)為CMIDD.2b），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所（南京）。 1.1.2 臨床標(biāo)本 自2003年2月至2005年2月，在本院門(mén)診和住院病人中采集。 1.1.3 對(duì)照用API20C鑒定系統(tǒng) 采用法國(guó)生物梅里埃產(chǎn)品。 1.1.4 真菌分離、鑒定檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自珠海市麗拓發(fā)展有限公司。 1.2 方法 1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株制備 在無(wú)菌條件下從真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株保存斜面中，用巴氏接種環(huán)接種到改良的沙氏瓊脂平板上，30 培養(yǎng)24 h48 h,再轉(zhuǎn)種活化一代備用。 1.2.2 臨床標(biāo)本的準(zhǔn)備 把標(biāo)本先接種到改良的

4、沙氏瓊脂培養(yǎng)基中，30 培養(yǎng)24 h48 h,再轉(zhuǎn)接活化一代后備用。 1.2.3 菌型鑒定 從制備好的標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床標(biāo)本分離平板中，分別挑取1個(gè)3個(gè)直徑大于1 mm擬似菌落，加入到鑒定培養(yǎng)基中，混勻。分別取150 l加入到檢測(cè)板的A2A5，B1B5鑒別微孔中。 1.2.4 藥敏試驗(yàn) 從混有菌落的鑒定培養(yǎng)基中取100 l菌懸液，加入到藥敏培養(yǎng)基中,混勻后分別取150 l加入到檢測(cè)板的A6A12，B6B12微孔中。 1.2.5 結(jié)果判斷 將檢測(cè)板放入濕盒中,于30 培養(yǎng)20 h24 h,當(dāng)B1孔出現(xiàn)明顯渾濁時(shí),各微孔加入顯色液1滴（B5孔除外），繼續(xù)培養(yǎng)2 h4 h觀察結(jié)果，結(jié)果判讀參照說(shuō)明書(shū)。

5、1.2.6 API20C操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 2 結(jié)果 2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株鑒定結(jié)果 兩種試劑對(duì)6株標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)完全一致,見(jiàn)表1。 表1 酵母樣真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定結(jié)果菌株（略） 3 討論 該實(shí)驗(yàn)方法集真菌藥敏和鑒定于一體，較傳統(tǒng)的藥敏和鑒定方法節(jié)省時(shí)間在24 h以上，有利于臨床早期判斷，早期治療的原則。本研究發(fā)現(xiàn)在真菌藥敏和鑒定中，標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床標(biāo)本分離株的活化和接種量對(duì)結(jié)果有一定的影響。菌株活化以二代左右為宜，以便獲得生長(zhǎng)力旺盛的純菌落，同時(shí)發(fā)現(xiàn)鑒定實(shí)驗(yàn)的接種量在104 cfu/ml105 cfu/ml為宜。藥敏試驗(yàn)接種量應(yīng)控制在103 cfu/ml左右，過(guò)高、過(guò)低接種量都不利于結(jié)果判斷。在藥敏試

6、驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)臨床感染真菌對(duì)咪唑類抗生素出現(xiàn)較多的耐藥性2，提示與近期臨床上大量使用該類抗生素而引起耐藥菌株增加有關(guān)，值得臨床注意。近年來(lái)，真菌感染特別是酵母類真菌感染明顯增加。隨著抗真菌藥物數(shù)量的增多和耐藥真菌的出現(xiàn)，臨床上迫切需要對(duì)真菌進(jìn)行鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)2。在國(guó)內(nèi)現(xiàn)有產(chǎn)品中，還沒(méi)有把真菌鑒定和藥敏試驗(yàn)在一個(gè)檢測(cè)板上，同時(shí)進(jìn)行快速檢測(cè)試劑盒，本實(shí)驗(yàn)采用試劑是利用真菌的特殊生化反應(yīng)和酶反應(yīng)，用活細(xì)胞線粒體酶特征顯色劑，對(duì)真菌進(jìn)行快速鑒定和藥敏試驗(yàn)，改變了過(guò)去通過(guò)觀察濁度來(lái)判斷結(jié)果的方法，顯色反應(yīng)鮮明，操作簡(jiǎn)便，判斷準(zhǔn)確，是一種比較先進(jìn)的技術(shù)方法，值得推廣4。 參考文獻(xiàn)： 1 王文莉，鄭瑋清，李若瑜，等采用NCCLS M27A方案微量法檢測(cè)念珠菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性J.中國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2001，24（2）：107108. 2 王慧.243株真菌感染菌株的耐藥性分析J.山東醫(yī)藥,2004，18（20）：5051. 3 劉先寧眼部常見(jiàn)酵母樣菌的快速鑒別及藥敏實(shí)驗(yàn)方法的建立J.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2003，18（2）：3435. 4 Tellier R, Krajden M, Grlgorie WGA, et al.Innovative endpoint determination system for an