免疫細(xì)胞化學(xué)常用試劑介紹

1、免疫細(xì)胞化學(xué)常用試劑介紹一、固定劑大多數(shù)神經(jīng)激素、肽類(lèi)物質(zhì)為水溶性，在用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，常需固定。但肽類(lèi)和蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)不同，因而對(duì)不同的固定方法或固定劑的反應(yīng)也不盡相同。某些固定劑甚至可同時(shí)破壞和/或保護(hù)同一抗原的不同抗原決定簇。因此，在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，很有必要了解所要研究的物質(zhì)（蛋白質(zhì)或肽類(lèi)）的化學(xué)性質(zhì)，并根據(jù)需要來(lái)選擇適宜的固定劑（或固定方法）以及改進(jìn)固定條件。目前，免疫細(xì)胞化學(xué)研究中常用的固定劑仍為醛類(lèi)固定劑，其中以甲醛類(lèi)和戊二醛最為常用。在此，簡(jiǎn)要介紹幾種目前較為常用和推薦的固定劑，以供讀者選用。1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.3）試劑

2、：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸緩沖液至1000ml配制方法：稱(chēng)取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500800ml 0.1mol/L磷酸緩沖液（Phosphate Buffer以下簡(jiǎn)稱(chēng)PB），加熱至60左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮，最后補(bǔ)足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混勻。該固定劑較適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，最好是動(dòng)物經(jīng)灌注固定取材后，繼續(xù)浸泡固定224h。另外，該固定劑較為溫和，適于組織標(biāo)本的較長(zhǎng)期保存。2.4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉試劑：A液：多聚甲醛40g蒸餾水400mlB液：Na2HPO4·

3、;2H2O16.88g蒸餾水300mlC液：NaOH3.86g蒸餾水200m配制方法：A液最好在500ml的三角燒瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷卻待用。注意，在溶解多聚甲醛時(shí)，要盡量避免吸入氣體或?yàn)R入眼內(nèi)。B液和C液配制好后，將B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 將pH調(diào)至7.27.4，最后，補(bǔ)充蒸餾水至1000ml充分混合，4冰箱保存?zhèn)溆?。該固定劑適于光鏡和電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，用于免疫電鏡時(shí)，最好加入少量新鮮配制的戊二醛，使其終濃度為0.5%1%。該固定劑較溫和，適于組織的長(zhǎng)期保存。組織標(biāo)本于該固定液中，4冰箱保存數(shù)月仍可獲得滿(mǎn)意的染色效果。3B

4、ouins液及改良Bouins液試劑：飽和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先將飽苦味酸過(guò)濾，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4冰箱中備用。冰醋酸最好在臨用前加入。改良Bouins液即不加冰醋酸。該固定液為組織學(xué)、病理學(xué)常用固定劑這一，對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整。但因偏酸（pH為33.5），對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮較明顯，故不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。此外，操作時(shí)，應(yīng)避免吸入或與皮膚接觸。4Zambonis(Stefaninis)液試劑：多聚甲醛20g飽和苦味酸 150mlKarasson-Schwlts PB至1000ml配制方法：稱(chēng)取多聚甲

5、醛20g，加入飽和苦味酸150ml，加熱至60左右，持續(xù)攪拌使充分溶解、過(guò)濾、冷卻后，加Karasson-Schwlts PB至1000ml充分混合（Karasson Schwlts磷酸緩沖液的配制配制方法見(jiàn)后）。該固定液適于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，對(duì)超微結(jié)構(gòu)的保存較純甲醛為優(yōu)，也適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，為實(shí)驗(yàn)室常用固定劑之一。我們?cè)趹?yīng)用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的飽和苦味酸，以增加其對(duì)組織的穿透力和固定效果，保存更多的組織抗原。固定時(shí)間為618h。5PLP液PLP液即過(guò)碘酸鹽-賴(lài)氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-aldehyde fixative

6、）試劑：過(guò)碘酸鈉賴(lài)氨酸鹽酸鹽（或鹽酸賴(lài)氨酸）：多聚甲醛蒸餾水配制方法：（1）貯存液A（0.1mol/L賴(lài)氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：稱(chēng)取賴(lài)氨酸鹽酸鹽1.827g溶于50ml蒸餾水中，得0.2mol/L的賴(lài)氨酸鹽酸鹽溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，將pH調(diào)至7.4，補(bǔ)足0.1mol/L的PB至100ml，使賴(lài)氨酸濃度也為0.1mol/L,4冰箱保存，最好兩周內(nèi)使用。此溶液的滲透濃度為300mOs mmol/L/kg。（2）貯存液B（8%多聚甲醛溶液）：稱(chēng)8g多聚甲醛加入100ml蒸餾水中，配成8%多聚甲醛液（方法見(jiàn)前）。過(guò)濾后4冰箱保存。（3）臨用前，以3

7、份A液與1份B液混合，再加入結(jié)晶過(guò)碘酸鈉（NaIO4），使NaIO4終濃度為2%。由于AB兩液混合，pH從約7.5降至6.2，故固定時(shí)不需再調(diào)pH值。固定時(shí)間為618h。該固定劑較適于富含糖類(lèi)的組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。其機(jī)制是借助于過(guò)碘酸氧化組織中的糖類(lèi)形成醛基，通過(guò)賴(lài)氨酸的雙價(jià)氨基與醛基結(jié)合，從而與糖形成交聯(lián)。由于組織抗原絕大多數(shù)都是由蛋白質(zhì)和糖兩部分構(gòu)成，抗原決定簇位于蛋白部分，故該固定劑有選擇性地使糖類(lèi)固定，這樣既穩(wěn)定了抗原，又不影響其在組織中的位置關(guān)系。Mclean和Nakane等認(rèn)為，最佳的混合是：含0.01mol/L的過(guò)碘酸鹽、0.075mol/L的賴(lài)氨酸、2%

8、的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸緩沖液。6Karnovskys液（pH7.3）試劑：多聚甲醛30g25%戊二醛80ml0.1mol/L PB至1000ml配制方法：先將多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混勻。該固定劑適于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，用該固定液在4短時(shí)固定，比在較低濃度的戊二醛中長(zhǎng)時(shí)間固定能更好地保存組織的抗原性和細(xì)微結(jié)構(gòu)。固定時(shí)最好先灌注固定，接著浸泡固定1030min，用緩沖液漂洗后即可樹(shù)酯包埋或經(jīng)蔗糖溶液后用于恒冷切片。70.4% 對(duì)苯醌 （Parabenzoquinone）試劑：對(duì)苯醌4.0g001mol/L PB

9、S1000ml配制方法：稱(chēng)取4.0g對(duì)苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。對(duì)苯醌對(duì)抗原具有較好的保護(hù)作用，但對(duì)超微結(jié)構(gòu)的保存有一定影響，故常與醛類(lèi)固定劑混合使用。一般要求臨用前配制，且避免加熱助溶，因加熱或放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，固定液變?yōu)樽厣梁稚?，?huì)使組織標(biāo)本背景增加，影響觀察。此外，對(duì)苯醌有劇毒，使用時(shí)避免吸入或與皮膚接觸。8PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）試劑：對(duì)苯醌20g多聚甲醛15g25%戊二醛40ml0.1mol/L二甲酸鈉緩沖液至1000ml配制方法：先以500ml左右的二甲酸

10、鈉緩沖液溶解對(duì)苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸鈉緩沖液至1000ml充分混合。對(duì)苯醌與戊二醛及甲醛聯(lián)合應(yīng)用，即可阻止醛基對(duì)抗原的損害，又不影響超微結(jié)構(gòu)的保存，故適于多種類(lèi)抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)，尤其是免疫電鏡的研究。9碳二亞酰胺-戊二醛（ECD-G）液試劑：0.05mol/L PB500ml0.01mol/L PBS 500mlTris約14g濃HCl 少許ECD 10g25%戊二醛3.5ml配制方法：先以約500ml的PB與相同體積的PBS混合，加入Tris（使其終濃度為1.4%）溶解，以濃HCl調(diào)pH至7.0，再將事先稱(chēng)取好的ECD和戊二醛加入混合液，振搖后計(jì)時(shí)，用pH計(jì)檢測(cè)，約

11、23min時(shí)，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min內(nèi)調(diào)pH至7.0，此時(shí)，將該混合固定液加入盛有細(xì)胞（經(jīng)PBS漂洗過(guò)）的器皿中，在23固定7min后，以PBS洗去固定液，即可進(jìn)一步處理。ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboiimide hydrochloride，簡(jiǎn)稱(chēng)乙基-CDI，常用于多肽類(lèi)激素的固定，對(duì)酶等蛋白質(zhì)的固定也有良好效果。ECD單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，邊緣固定效應(yīng)重，但與戊二醛、Tris及PB聯(lián)合應(yīng)用，效果明顯改善，細(xì)胞質(zhì)仍可滲透，利用細(xì)胞中抗原的定位，超微結(jié)構(gòu)保存較好。目前認(rèn)為是一種用于培養(yǎng)細(xì)胞電鏡水平

12、免疫細(xì)胞化學(xué)研究的很好的固定劑。10四氧化鋨（鋨酸Osmic Acid, OsO4）配制：將洗凈裝有OsO4的安瓿中加熱后，迅速投入裝有溶劑的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用鉆石刀在安瓿上劃痕，洗凈后再放入瓶中，蓋好瓶塞，用力撞擊安瓿，待其破后加溶劑稀釋。為保證充分溶解，應(yīng)在用前幾天配制。（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作為儲(chǔ)備液，于冰箱中密封保存。（2）1% OsO4-PB：試劑：A、2.26%NaH2PO4·2H2O4.15mlB2.52%8.5mlC、5.4%葡萄糖5mlD、OsO40.5g配制方法：先分別配好A、B、C三種液體，取A液41.5ml

13、與B液8.5ml混合，將pH調(diào)至7.37.4，取AB混合液45ml再與5ml C液混合即為0.12mol/L PBG。（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.27.4）：試劑：2% OsO4水溶液10ml0.2mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.27.4）10ml配制方法：取2%OsO4儲(chǔ)備液10ml與等量0.2mol/L、pH7.27.4的二甲胂酸鈉緩沖液充分混合即可。OsO4是電鏡研究所必需的試劑，常用于后固定。盡管OsO4主要為脂類(lèi)固定劑，但也可與肽類(lèi)及蛋白質(zhì)起作用，形成肽-蛋白質(zhì)或肽-脂交聯(lián)。過(guò)氧化物酶的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)OsO4處理后，電子密度增高，適于電鏡研究。但由

14、于OsO4的反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)光及電子有較明顯的吸收能力，因此在免疫細(xì)胞化學(xué)染色前常需去除，去鋨在光鏡水平常用1%的高錳酸鉀，在電鏡水平則常用H2O2來(lái)處理。以上介紹了目前免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的一些固定液。關(guān)于固定液種類(lèi)還很多，如70%90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%1%醋酸的70%90%的酒精等），這些溶液都能促使蛋白質(zhì)凝固。它們最初只是光學(xué)顯微鏡通用的固定液，但在免疫細(xì)胞化學(xué)上用其它方法不成功時(shí)，也可試用?？傊莆找粋€(gè)原則，免疫細(xì)胞化學(xué)中，含重金屬的固定液禁用（但Zenker-Formalin可進(jìn)行短時(shí)的固定）。目前多數(shù)認(rèn)為，對(duì)生物標(biāo)本較好的固定措施是：用4的Karnovskys液灌注固定

15、1030min后，接著在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液中漂洗過(guò)液，這種短時(shí)冷固定處理，有助于超微結(jié)構(gòu)和許多肽類(lèi)抗原的保存。對(duì)其它較難保存的抗原可嘗試PFG、PLP及Zambonis液等混合固定液。二、緩沖液免疫細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用的緩沖液種類(lèi)較多，即使是同種緩沖液，其濃度、pH、離子強(qiáng)度等也常常不同。在此介紹幾種最常用的緩沖液的配制。10.2mol/L(pH7.4)磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer, PB）試劑： NaH2PO4·2H2ONa2HPO4·12H2O配制方法：配制時(shí)，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2H

16、PO4，兩者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（PB），根據(jù)需要可配制不同濃度的PB和PBS。（1）0.2mol/L的 Na2HPO4；稱(chēng)取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。（2）0.2mol/L的 Na2HPO4：稱(chēng)取NaHPO4.·12H2o 71.632g（或 Na2HPO4·7H2O 53.6g或 Na2HPO4·2H2o 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。 （3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和

17、81ml 0.2mol/L的 Na2HPO4·12H2O,充分混合即為0.2mol/L的PB（pH約為7.47.5）。若pH偏高或偏低，可通過(guò)改變二者的比例來(lái)加以調(diào)整，室溫保存即可。20.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水（Phosphate Buffered Saline, PBS）試劑：0.2mol/L PB50mlNaCl 8.59g(約0.15mol/L)重蒸水 至1000ml配制方法：稱(chēng)取NaCl 8.59g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分搖勻即可。若擬配制0.02mol/L的PBS，則PB量加倍即可，依此類(lèi)推。

18、PB和PBS是免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中最為常用的緩沖液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗組織標(biāo)本、稀釋血清等，其pH應(yīng)在7.257.35之間，否則需要調(diào)整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情況下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀釋成0.01mol/L的PBS時(shí)，常可達(dá)到要求的pH值，若需調(diào)整pH，通常也是調(diào)PB的pH。3Karasson Schwlts磷酸鹽緩沖液試劑： NaH2PO4·H2O3.31gNa2HPO4·7H2O33.77g重蒸水 至1000ml配制方法：同前該緩沖液主要用于配制Zambonis固定液。40.5mol/L pH7.6

19、的Tris- HCl緩沖液。試劑：Tris(三羥甲基氨基甲烷)60.57g1N HCl約420ml重蒸水 至1000ml配制方法：先以少量重蒸水（300500ml）溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH將pH調(diào)至7.6，最后加重蒸水至1000ml。此液為儲(chǔ)備液，于4冰箱中保存。免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的Tris-HCl緩沖液濃度為0.05mol/L，用時(shí)取儲(chǔ)備液稀釋10倍即可。該液主要用于配制Tris緩沖生理鹽水（TBS）、DAB顯色液。5Tris緩沖生理鹽水（Tris Buffered,Saline,TBS）試劑：0.5mol/L Tris-HCl緩沖液100mlNaCl3.5

20、9g(0.15mol/L)重蒸水至1000ml配制：先以重蒸水少許溶解NaCl,再加Tris-HCl緩沖液，最后加重蒸水至1000ml，充分搖勻使Tris終濃度為0.05mol/L。TBS主要用于漂洗標(biāo)本，常用于免疫酶技術(shù)中。6Tris-TBS(PBS)試劑：Triton X-10010ml(1%)或3ml(0.3%)0.5mol/L Tris緩沖液（pH7.6）1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)NaCl8.59g重蒸水至1000ml配制方法：先以重蒸水少許溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris緩沖液或（PB），最后加重蒸水至1000ml，充分搖勻。該液常用濃

21、度為1%及0.3%，前者主要用于漂洗標(biāo)本，后者主要用于稀釋血清。70.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸緩沖液試劑：0.2mol/L二甲胂酸鈉500ml0.1N HCl28ml蒸餾水至1000ml配制方法：先稱(chēng)取二甲胂酸鈉（MW：214）42.8g,加蒸餾水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸鈉溶液；再取HCl 1.7ml加蒸餾水至1000ml ,配成0.1N，最后 取0.2mol/L二甲胂酸鈉溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸餾水至1000ml，即為0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液。8幾種常用的不同pH值緩沖液的配制表（1）0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH5.7

22、8.0）pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2HPO4(ml)5.793.56.55.892.08.05.990.010.06.087.712.36.185.015.06.281.518.56.377.522.56.473.526.56.568.531.56.662.537.56.756.543.56.851.049.06.945.055.07.039.061.07.133.067.07.228.072.07.323.067.07.419.081.07.516.084.07.613.087.07.710.589.57.88.591.57.97.093.08.05.

23、394.7(2)0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.199.10）pH0.2mol/L Tris(ml)0.2mol/L HCl(ml)H2O7.1910.018.012.07.3610.017.013.07.5410.016.014.07.6610.014.015.07.7710.014.016.07.8710.013.017.07.9610.012.018.08.0510.011.019.08.1410.010.020.08.2310.09.021.08.3210.08.022.08.4110.07.023.08.5110.06.024.08.6210.05.025.08.

24、7410.04.026.08.9210.03.027.09.1010.02.028.0(3)0.2mol/L醋酸鹽緩沖液（pH3.65.6）pH0.2mol/L醋酸（ml）0.2mol/L醋酸鈉（ml）3.646.33.73.844.06.04.041.09.04.236.813.24.430.519.54.625.524.54.820.030.05.014.835.25.210.539.55.48.841.25.64.845.2(4)0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH5.07.4）pH0.2mol/L二甲胂酸鈉（ml）0.2N HCl(ml)蒸餾水5.02523.551.55.22522

25、.552.55.42521.553.55.62519.655.55.82517.457.56.02514.860.36.22511.963.16.4259.265.86.6256.768.36.8254.770.37.0253.271.87.2252.172.97.4251.473.6注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸鈉-HNO3緩沖液。（5）0.2mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.210.7）pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3(ml)9.24.046.09.37.542.59.49.540.59.513.037.09.616.034.09.719.

26、530.59.822.028.09.925.025.010.027.522.510.130.020.010.233.017.010.335.514.510.438.511.510.540.59.510.642.57.510.745.05.0三、顯色液免疫細(xì)胞化學(xué)中，由于抗原-抗體反應(yīng)所形成的復(fù)合物本身無(wú)色，無(wú)法直接觀察，因而需借助于某些化學(xué)基團(tuán)的呈色作用，使其得以顯示，以利于在顯微鏡下觀察。常用的顯色液有：1DAB（Diaminobenzidine）顯色液DAB即3，3-二氨基苯聯(lián)胺試劑：DAB（常用四鹽酸鹽）50mg0.05mol/L TB 100ml30% H2O23040l配制方法：先以

27、少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分搖勻，使DAB終濃度為0.05%,過(guò)濾后顯色前加入30%的H2O23040l，使其終濃度為0.01%。DAB顯色液主要用于免疫過(guò)氧化物酶法（如酶標(biāo)法、PAP法等），其終產(chǎn)物可直接在光鏡下觀察，也可經(jīng)OsO4處理后，增加反應(yīng)產(chǎn)物的電子密度，用于電鏡觀察。但有幾點(diǎn)需注意：DAB溶解要完全，否則未溶解的顆粒沉積于標(biāo)本上影響觀察；DAB濃度不易過(guò)高，否則顯色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量避免與皮膚接觸，用后及時(shí)徹底沖洗，接觸DAB的實(shí)驗(yàn)用品最好經(jīng)洗液浸泡24h后使用。24-氯-1-萘酚（4

28、-Cl-1-Naphthol）顯色液配方1：4-Cl-1-萘酚 100mg純乙醇 10ml0.05mol/L TB(pH7.6)190ml30% H2O2 10l(0.003%)配制方法：先將4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其終濃度為0.005%，切片顯色時(shí)間通常為520min。配方2：4-Cl-1-萘酚N-二甲基甲酰胺（DMF）0.05mol/L TB(pH7.6)30% H2O2配制方法：先將4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加熱溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色變?yōu)樾鯛?，?.5加熱5min后加入H2O2，攪動(dòng)使絮狀消失，趁熱過(guò)濾，當(dāng)降至略

29、低于50時(shí)才放入組織標(biāo)本（注意：溫度過(guò)高易損傷標(biāo)本，過(guò)低則易重新出現(xiàn)沉淀）。顯色時(shí)間通常為5min左右。4-Cl-1-萘酚的終產(chǎn)物顯示藍(lán)色。多數(shù)認(rèn)為最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等認(rèn)為，白色沉淀可作為背景，使陽(yáng)性部位更易觀察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚顯色的組織標(biāo)本，勿用酒精脫水。33-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）顯色液試劑：AEC20mg二甲基甲酰胺（DMF）2.5ml0.05mol/L醋酸緩沖液（pH5.5）50ml30%H2O225ml配制方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻。臨顯色前，加入30%H2

30、O2。切片顯色時(shí)間為520min。該顯色液作用后，陽(yáng)性部分呈深紅色，加以蘇木精或亮綠等作為背景染色，則效果更佳。由于終產(chǎn)物溶于酒精和水，故需用甘油封固。4TMB顯色液試劑：TMBHCl亞硝基鐵氰化鉀無(wú)水酒精配制方法：（1）醋酸鹽緩沖液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸鈉400ml中混合，再加蒸餾水稀釋至1000ml，用醋酸或NaOH將pH調(diào)至3.3。（2）A液：取上述緩沖液5ml，溶解100mg亞硝基鐵氰化鉀，加蒸餾水92.5ml混合。（3）B液：稱(chēng)取5mg TMB加入2.5ml無(wú)水酒精中，可加熱至3740直到TMB完全溶解。（4）孵育液：放入標(biāo)本前數(shù)秒，取2.

31、5ml B液及97.5ml A溶于試管中充分混合。（液體在20min內(nèi)應(yīng)保持清亮的黃綠色，否則可能已有污染）。酶反應(yīng)時(shí)，加入終濃度為0.005%的H2O2。（5）主要顯色步驟：組織標(biāo)本在蒸餾水（或PBS）中漂洗數(shù)次（每次約1015min）后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（1930），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.05.0ml）繼續(xù)孵育液20min左右（1923），撈出標(biāo)本漂洗數(shù)次（共30min左右）。在04條件下可在漂洗液放置4h直至貼片、脫水，封片。也可在貼片前在1%的中性紅中負(fù)染23min，也可在1%派諾寧（pH3.33.5）中負(fù)染5m

32、in后貼片、脫水、封片。TMB即四甲基聯(lián)苯胺（Tetrabenzidine）是一種脂溶性較強(qiáng)的基團(tuán)，因此容易進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞器中的HRP反應(yīng)，且由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深蘭色沉淀物，這使得TMB成為組化實(shí)驗(yàn)中的一種很好的發(fā)色團(tuán)。同時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反應(yīng)進(jìn)行。TMB的反應(yīng)產(chǎn)物為深藍(lán)色，利于光鏡觀察，且反應(yīng)產(chǎn)物越聚越大，常超出單個(gè)細(xì)胞器的范圍（而DAB則被限制在其內(nèi)），故TMB反應(yīng)的檢測(cè)閾較低。由于上述優(yōu)點(diǎn)，目前TMB常用于光鏡及超微結(jié)構(gòu)水平的HRP及HRP-WGA神經(jīng)投射的研究。需要注意的是：TMB顯色液中的A液和

33、B液應(yīng)在2h內(nèi)新鮮配制。另外，TMB是一種較強(qiáng)的皮膚刺激劑，并有致癌的潛在可能，故使用時(shí)應(yīng)帶手套及在通風(fēng)條件下操作。5NBT顯色液試劑A液：5%NBT：稱(chēng) 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）內(nèi)，充分混合，常存于4，也可裝成小份，-20保存，用前復(fù)溫。B液：5% BCIP：稱(chēng)取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF內(nèi)，混勻。4或分裝存于-20，用前恢復(fù)至室溫。C顯色液：取A液40l，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,鈐0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管內(nèi)，充分混勻；再加入B液40l，輕輕混合即可。最好用前

34、新鮮配制。NBT即四唑氮藍(lán)（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,為深藍(lán)色無(wú)定形微溶物質(zhì)。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。當(dāng)二者存在時(shí)，在堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被還原形成顯微鏡下可見(jiàn)的藍(lán)色或紫色沉淀。四、粘附劑在免疫細(xì)胞化學(xué)工作中，由于標(biāo)本（如切片）的脫落常影響工作的質(zhì)量的速度，故粘附劑的選擇和使用就顯得較為重要。1鉻礬明膠液試劑：鉻礬0.5g明膠（Gelatine）5gH2O 1000ml方法：在1000ml的燒杯或燒瓶中，以5

35、00800ml H2O加溫溶解明膠，待其完全溶解后，再加入鉻礬。注意溫度過(guò)高易使明膠燒糊，包被玻片時(shí)最好控制水溫在70。如有明顯殘?jiān)?，過(guò)濾后使用。2甲醛-明膠液試劑：40%甲醛2.5ml明膠0.5g蒸餾水至100ml配制方法：用少許蒸餾水（約80ml）加熱溶解明膠，待完全溶化后，加入甲醛，最后補(bǔ)充蒸餾水至100ml混勻即可。3多聚賴(lài)氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）試劑：多聚賴(lài)氧酸 5g蒸餾水 1000ml配制方法：稱(chēng)取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液濃度為0.5%，可適當(dāng)稀釋配成0.010.5%濃度。4保存，也可-20備用。PLL可反復(fù)冰凍，效果無(wú)明顯影響，工作液常再稀釋105

36、0倍。4Vectabond試劑該試劑是Vector公司新進(jìn)推出的一種新型玻片粘附劑。該試劑與一般的粘附劑不同，它是通過(guò)對(duì)玻璃表面起化學(xué)修飾作用，改變其表面的化學(xué)物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，貼上后不易脫落，保留時(shí)間較久。一個(gè)試劑盒（7ml）可配成350ml工作液（用丙酮配）。處理載玻片前（事先酸處理），用染色缸裝好各種液體，按下列程序進(jìn)行：干凈載玻片丙酮5minVectabond試劑工作液（7ml Vectabond+ 350ml丙酮）：將載玻片用鑷子夾住浸入Vectabond試劑12次dH2O，2×5min干燥（37過(guò)夜）用鋁箔包好，室溫存放備用。注意：避免污染（塵埃等）。綜上述方法處理的載片一般可存放半年以上。五、封固劑1甘油-TBS及甘油-PBS配制方法：按比例將甘油和TBS（或PBS）充分混合后，置4，冰箱靜止；待氣泡排除后方可使用。2甘油-明膠