質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定

1、LOGO質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定2011年年5月月9日日 主要內(nèi)容主要內(nèi)容實驗?zāi)康募霸韺嶒災(zāi)康募霸?實驗過程實驗過程2實驗結(jié)果實驗結(jié)果3思考題思考題4一、實驗?zāi)康募霸矶?、實驗原理v質(zhì)粒質(zhì)粒(Plasmid) (Plasmid) ： 獨立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的獨立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子，是一種環(huán)狀的雙鏈遺傳因子，是一種環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子。分子。 存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。胞中，在細菌細胞中最多。 本實驗采用本實驗采用SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）堿裂解法

2、提?。ㄊ榛蛩徕c）堿裂解法提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA。將細菌懸浮液暴露于高。將細菌懸浮液暴露于高pHpH值的強陰離子洗滌值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNADNA和蛋白質(zhì)變性，將和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA釋放到上清中。在裂解過程中，細菌蛋白質(zhì)、釋放到上清中。在裂解過程中，細菌蛋白質(zhì)、破裂的細胞壁和變性的染色體破裂的細胞壁和變性的染色體DNADNA會相互纏繞成大型復(fù)會相互纏繞成大型復(fù)合物，被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用合物，被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用K K+ +取代取代NaNa時，這時，這些復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來。離心除去變性劑些復(fù)合物會

3、從溶液中有效地沉淀下來。離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNADNA。v 限制性核酸內(nèi)切酶（限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonucleaserestriction endonuclease）是一）是一類能識別雙鏈中特定堿基順序的核酸水解酶，這類能識別雙鏈中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)。些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)。v 根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為酶活性可分為、型三大類，我們這里用到的是型三大類，我們這里用到的是型。型。v 型限制性內(nèi)

4、切酶它們能識別雙鏈的特異順序，型限制性內(nèi)切酶它們能識別雙鏈的特異順序，并在這個順序內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異的片段。并在這個順序內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異的片段。 如如EcoEcoRIRI的識別順序為：的識別順序為： 5 G5 G| |AATTC 3AATTC 3 3 CTTAA 3 CTTAA| |G 5G 5 在雙鏈上交錯切割的位置切割后生成在雙鏈上交錯切割的位置切割后生成 5G AATTC3 5G AATTC3 3CTTAA G5 3CTTAA G5三、實驗材料與試劑（一）材料（一）材料 大腸桿菌大腸桿菌DH5DH5（含有攜帶插入片段（含有攜帶插入片段gcpgcp的質(zhì)粒的質(zhì)粒PMD19-TPMD19

5、-T）三、實驗材料與試劑（二）試劑（二）試劑 (1)(1)溶液溶液: : TrisHCl(pH8.0) 25mmol/L TrisHCl(pH8.0) 25mmol/L EDTA(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) 10mmol/L 葡萄糖葡萄糖 50mmol/L50mmol/L (2) (2)溶液溶液(新鮮配制新鮮配制) :) : NaOH 0.2mol/L NaOH 0.2mol/L SDS 1%(W/V) SDS 1%(W/V) (3)(3)溶液溶液(100ml):(100ml): 5mol/L 5mol/L乙酸鉀乙酸鉀 60ml60ml 冰乙酸冰乙酸 11.5ml(

6、pH4.8)11.5ml(pH4.8) 水水 28.5ml28.5ml (4) (4) 苯酚苯酚 (5) (5) 氯仿：異戊醇（氯仿：異戊醇（24:124:1） (6) (6) 無水乙醇、無水乙醇、70%70%乙醇、醋酸鈉（乙醇、醋酸鈉（pH5.2pH5.2）（三）限制性內(nèi)切酶（三）限制性內(nèi)切酶 1 1）EcoEcoRIRI 識別順序為：識別順序為：5 G5 G| |AATTC 3AATTC 3 3 CTTAA 3 CTTAA| |G 5G 5 2 2）XhoIXhoI 識別順序為：識別順序為：5 C5 C| |TCGAG 3TCGAG 3 3 GAGCT 3 GAGCT| |C 5C 5四、

7、實驗步驟1. 1. 挑轉(zhuǎn)化后的單菌落接種到含有適當抗生素挑轉(zhuǎn)化后的單菌落接種到含有適當抗生素(Amp)(Amp)的的LBLB液液體培養(yǎng)基中體培養(yǎng)基中,37,37振蕩培養(yǎng)過夜。振蕩培養(yǎng)過夜。2. 2. 將將1ml1ml的培養(yǎng)物倒入的培養(yǎng)物倒入1.5ml1.5ml的的EPEP管中管中, , 44、12000rpm12000rpm離離心心1min1min。棄去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥。棄去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥。3. 3. 將細菌沉淀重懸于將細菌沉淀重懸于100100l l冰預(yù)冷的溶液冰預(yù)冷的溶液中中, , 吹打沉吹打沉淀至完全混勻淀至完全混勻( (無塊狀懸浮無塊狀懸浮) )。4. 4.

8、加加200200l l新配制的溶液新配制的溶液,立即溫和顛倒離心管立即溫和顛倒離心管5 5次，次，使菌體充分裂解使菌體充分裂解, , 切勿振蕩切勿振蕩! !將離心管放置于冰上將離心管放置于冰上1-1-2min2min。( (不要超過不要超過2min)2min)。5. 5. 加加150150l l用冰預(yù)冷的溶液用冰預(yù)冷的溶液III,III, 反復(fù)溫和顛倒反復(fù)溫和顛倒5 5次次, , 將將管置于冰上管置于冰上3 35min5min。6. 4 6. 4 、12000rpm12000rpm離心離心15min,15min,將上清液約將上清液約400ul400ul轉(zhuǎn)移到另轉(zhuǎn)移到另一離心管中。一離心管中。7

9、. 7. 加加1/21/2體積的苯酚，體積的苯酚，1/21/2體積的氯仿：異戊醇（體積的氯仿：異戊醇（24:124:1）振蕩混勻。振蕩混勻。 4 4 、12000rpm12000rpm離心離心10min10min，將上清液約，將上清液約400ul400ul轉(zhuǎn)移到另一離心管中。轉(zhuǎn)移到另一離心管中。8. 8. 加加2 2倍體積的無水乙醇和倍體積的無水乙醇和1/101/10體積的醋酸鈉沉淀質(zhì)粒體積的醋酸鈉沉淀質(zhì)粒DNA,DNA,振蕩混勻振蕩混勻, ,于于20 20 放置放置15min15min。9.4 9.4 、12000rpm12000rpm離心離心5min5min。小心除去上清液，將附于管。小心

10、除去上清液，將附于管壁的液滴除盡。壁的液滴除盡。10. 10. 加加1ml 701ml 70乙醇溶液洗滌沉淀，乙醇溶液洗滌沉淀，4 4 、12000rpm12000rpm離心離心5min5min。棄去上清液，在空氣中使。棄去上清液，在空氣中使DNADNA沉淀干燥。沉淀干燥。11. 11. 用用2020l l滅菌的蒸餾水溶解滅菌的蒸餾水溶解DNA,DNA,加加1 1l l胰胰RNARNA酶消化酶消化RNA 30minRNA 30min。（二）雙酶切及電泳檢測I 1.5ulI 1.5ulXhoI 1.5ulXhoI 1.5ul1010Buffer 2ulBuffer 2ulDDW 8ulDDW 8ul五、實驗結(jié)果v質(zhì)粒電泳圖質(zhì)粒電泳圖 有三條條帶，分別是超螺旋、線性和開環(huán)結(jié)構(gòu)