重組人G-CSF免疫小鼠全套單鏈抗體噬菌體表面展示文庫的構(gòu)建_第1頁
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1、重組人GCSF免疫小鼠全套單鏈抗體噬菌體表面展示文庫的構(gòu)建關(guān)鍵詞GCSF單鏈抗體噬菌體表面展示基因文庫摘要利用全套噬菌體抗體表面展示技術(shù),繞過雜交瘤技術(shù),從重組人GCSF免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,用抗體可變區(qū)PCR混合引物進(jìn)行全套抗體重、輕鏈可變區(qū)(VH和VL)基因的擴增。經(jīng)重疊延伸反應(yīng),在體外隨機裝配成單鏈抗體(ScFv)。將其克隆至噬菌粒載體pCANTAB5E中,電轉(zhuǎn)化含SupE的菌株,以輔助噬菌體M13KO7超感染噬菌粒文庫,構(gòu)建成全套ScFv表面展示文庫。為利用親和富集篩選技術(shù),獲得具有GCSF結(jié)合活性的完整重組噬菌??寺〉於嘶A(chǔ)。中國書資料分類號Con

2、struction of a phage display library of repertoire singlechain Fv antibodies from mouse immunized with recombinant human granulocytecolonystimulating factor (GCSF) Jia Songhui , Guo Yao1 (Department of Pathophysiology, 1Department of Radiation Medicine, the Fourth Military Medical University, Xian 7

3、10032) Fan Lingzhi, Liang Mifang, Hou Yunde (National Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Chinese Academy Preventive Medicine) Keywords GCSF singlechain Fv antibody phage display cDNA library Abstract Using phage display technique we constructed a library of repertoire immunogl

4、obulin from mouse immunized with recombinant human granulocytecolony-stimulating factor (GCSF). The heavy-chain and kappa lightchain variable region gene (VH and VL) repertoire of immunoglobulin were amplified individually from the spleen cell mRNA by RTPCR and joined by a DNA linker encoding peptid

5、e (GGGGS)3 as a single? chain Fv (ScFv) DNA fragment with overlap extension. These fragments were cloned into the phagemid pCANTAB 5E and expressed as a fusion protein with phage M13 P in E.coli TG1.In the presence of helper phage M13KO7, the ScFv fusion protein were displayed on the surface of reco

6、mbinant phages. 粒系集落刺激因子(GCSF)具有特異地刺激和調(diào)節(jié)粒細(xì)胞系統(tǒng)增殖、分化、存活和活化等作用1,在放射損傷的救治及腫瘤患者放、化療的輔助治療等方面具有重要作用。但由于嗜中性粒細(xì)胞在組織內(nèi)的大量聚積和激活,可通過“呼吸爆發(fā)”效應(yīng)釋放出大量氧自由基等多種成分,在清除異己的同時也將對自身組織產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。這已成為多器官功能衰竭、成人呼吸窘迫綜合征及全身性炎癥反應(yīng)綜合征等嚴(yán)重病理過程的一個重要機制2。因此,保持體內(nèi)粒細(xì)胞的動態(tài)平衡是對一些臨床疾病診治的重要環(huán)節(jié)。由于粒細(xì)胞的激活和釋放反應(yīng)受多種因素(包括多種細(xì)胞因子)的影響和調(diào)節(jié)3,而GCSF則能夠特異性地刺激和調(diào)節(jié)粒細(xì)胞系統(tǒng)

7、的增殖和活化,因此,研究其在炎性抗炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的作用及地位就十分必要。其中研制和應(yīng)用抗GCSF抗體將是一個重要的途徑。本實驗利用90年代發(fā)展起來的全套抗體噬菌體表面展示系統(tǒng)4,繞過雜交瘤技術(shù),從重組人GCSF免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞mRNA出發(fā),利用重疊延伸反應(yīng)在體外隨機拼接抗體可變區(qū)基因,最終構(gòu)建了全套單鏈抗體(ScFv)噬菌體表面展示文庫,為利用親和富集篩選技術(shù),獲得具有GCSF結(jié)合活性的完整重組噬菌??寺〉於嘶A(chǔ)。1材料和方法1.1材料噬菌粒載體及輔助噬菌體噬菌粒載體pCANTAB5E,為Pharmacia公司產(chǎn)品。其中含有氨芐抗性基因(Ampr),Plac啟動子及M13噬菌體間隔區(qū)片

8、段,用于克隆ScFv基因的Sfi,Not克隆位點及Etag序列和瑚珀終止碼TAG。輔助噬菌體M13KO7,為Pharmacia公司產(chǎn)品,帶有突變型基因、質(zhì)粒復(fù)制起點和卡那霉素抗性基因(Kanr),在其輔助下可使前者產(chǎn)生含單鏈?zhǔn)删;蚪M的噬菌體顆粒。細(xì)菌菌株E.coliTG1為Pharmacia公司產(chǎn)品,用于ScFv噬菌體表面展示。PCR反應(yīng)系統(tǒng)TagDNA聚合酶和dNTP,為德國Boehringer Mannheim產(chǎn)品;PCR引物為Pharmacia產(chǎn)品,其中Heavychain primer1和2分別為VH基因5端和3端引物,用來擴增鼠IgVH基因。Lightchain primer m

9、ix為10種VL基因5端和3端引物的混合物,用來擴增鼠IgVL基因。Linker primer mix為含有兩條互補、各有93個堿基序列、帶有Linker(GGGGS)3序列的VH基因3端和VL基因5端引物的等摩爾數(shù)混合物。該引物兩端的各24個堿基分別與VH和VL基因的3端和5端相互補,從而可將VH和VL基因片段拼接成ScFv基因。RS primer mix為帶有Sfi位點的重鏈基因5端引物和帶有Not位點的輕鏈基因3端引物的混合物,用來擴增ScFv基因片段同時引入克隆位點。試劑TRIzol試劑、cDNA合成試劑及各種限制性核酸內(nèi)切酶等,分別為Boehringer Mannheim公司、Pha

10、rmacia公司、Biolabs公司、Life Technologies公司或華美公司產(chǎn)品;G-CSF為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院邦定公司產(chǎn)品(純度大于95且不含白蛋白保護(hù)劑)。1.2方法動物免疫出生后6周齡雌性Balb/c小鼠10只(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物繁育場提供)體重17g20g,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機分為5組,每組2只。分別以5g,10g,20g和50g等不同劑量GCSF加福氏完全佐劑(等體積)進(jìn)行初次免疫。對照組以生理鹽水代替GCSF。3周后進(jìn)行第2次免疫,以GCSF(劑量同前)加福氏不完全佐劑(等體積)皮下多點注射。第6周時進(jìn)行第3次免疫,以GCSF(劑量同前)不加佐劑腹腔注射。第7周時,取小鼠血

11、清以常規(guī)ELISA法檢測抗體滴度。滴度達(dá)110000后,立刻進(jìn)行第4次免疫,以加倍劑量的GCSF不加佐劑腹腔注射。第8周以GCSF(劑量同前)進(jìn)行加強免疫,不加佐劑腹腔注射,連續(xù)免疫3d。小鼠脾細(xì)胞總RNA的提取加強免疫結(jié)束后,取免疫效果較好的小鼠1只立即處死,迅速取出脾臟,按TRIzol試劑說明書要求提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈參照Boehringer Mannheim公司的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)產(chǎn)品說明書,以總RNA為模板,OligodT(15)為引物,在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA第1條鏈。全套VH和VL基因的擴增以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第1條鏈為模板,按下列體系分別進(jìn)行全套VH和VL

12、基因的擴增。擴增全套VH基因:模板5l,Heavy-chain primer1和Heavy-chainprimer2各1l,dNTP(2.5mmol/每種核苷酸L)4l,10PCR緩沖液5l,無菌雙蒸水33l。于100預(yù)變性5min,0冰浴5min后,加TagDNA聚合酶5U(1l)。擴增全套VL基因:除應(yīng)用Lightchain primer mix2ml代替上述引物外,其它均相同。PCR反應(yīng)參數(shù)為:9445s,551min,721min,30個循環(huán)后,72延伸10min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5瓊脂糖凝膠電泳,用MicroSpin columns柱回收目的基因片段。全套VH,VL基因的隨機拼接

13、純化回收的VH,VL基因片段,用VHmarker在紫外燈下定量分析后,與Linker primer mix以相同或接近等摩爾濃度混合,按下列體系進(jìn)行連接PCR反應(yīng):純化VH和VL基因的PCR產(chǎn)物各50ng,Linker primer mix4l,10PCR緩沖液5l,dNTP(10mmol/每種核苷酸L)4l,以無菌雙蒸水補充至總體積為50l。100預(yù)變性5min,0冰浴5min后,加TagDNA聚合酶5U(1l)。PCR反應(yīng)的參數(shù)為:941min,634min,循環(huán)7次后延伸5min,從而將全套VH,VL基因隨機拼接成ScFv。 全套ScFv基因的第2次PCR擴增 準(zhǔn)備下列反應(yīng)體系:TagD

14、NA聚合酶5U(1l),10PCR緩沖液5l,dNTP(10mmol/每種核苷酸L)2l,RSprimermix4l,無菌雙蒸水38l。將上述反應(yīng)體系加入7次循環(huán)后的PCR管內(nèi),繼續(xù)進(jìn)行30次循環(huán)。循環(huán)條件為:941min,551min又30s,722min。循環(huán)結(jié)束后,72延伸10min。全套ScFv基因的克隆將第2次PCR擴增產(chǎn)物加至含有SephacrylS400HR樹脂的MicroSpincolumn柱內(nèi)進(jìn)行回收。對所獲純化的ScFv基因片段用Sfi和Not消化,再次用相同方法純化回收。經(jīng)用ScFvmarker定量分析后,將全套ScFv基因片段與pCANTAB5E載體在T4DNA連接酶(

15、5U7U)作用下進(jìn)行連接。同時做載體自連和陽性插入(controlinsert)。制備電轉(zhuǎn)化的TG1感受態(tài)細(xì)胞。取2l連接產(chǎn)物加入100l電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)菌液中,在pulser電轉(zhuǎn)化儀中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入至37預(yù)溫的1mlSOC培養(yǎng)液中,溫浴1h后,取100l涂于SOBAG(含有100mg/L氨芐青霉素和2葡萄糖的SOB培養(yǎng)基)瓊脂板上,30培養(yǎng)24h。全套ScFv基因的噬菌體表面展示及鑒定從生長良好的SOBAG平皿上,挑取22個單菌落快提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定后,用2YTAG(含有100mg/L氨芐青霉素和2葡萄糖的2YT培養(yǎng)基)5ml將板上所有菌落洗下。取部分菌液用2YTAG10ml稀釋至A

16、600為0.2后,于37振蕩培養(yǎng)(250r/min)1h。至對數(shù)生長期后,加入51010pfu的M13KO7輔助噬菌體,37振蕩培養(yǎng)1h。4000r/min離心10min,棄上清后將沉淀細(xì)胞再懸浮于10ml2YTAK(含有100mg/L氨芐青霉素和50mg/L卡那霉素的2YT培養(yǎng)基)中,37振蕩培養(yǎng)(250r/min)過夜。5000r/min離心20min,收集上清即為全套ScFv基因的噬菌體表面展示文庫。將所得文庫做108,109,1010,1011和1012梯度稀釋,進(jìn)行噬斑培養(yǎng)實驗,觀察噬斑生長情況以判斷ScFv基因噬菌體表面展示文庫的滴度。2結(jié)果2.1全套VH,VL基因片段的擴增和鑒定

17、以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第1條鏈為模板,加入針對鼠IgV區(qū)基因不同家族的重鏈和輕鏈可變區(qū)引物進(jìn)行PCR,即得到了全套抗體VH和VL基因。電泳結(jié)果顯示,擴增出的VH和VL()基因片段約為350bp,VH略大于VL(1),與預(yù)期的片段大小相符。1VH和VL基因PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳Fig 1 Gel electrophoresis of PCR products of VH and VL genes M: pBR322/Hinf marker 1613, 517, 506, 396, 344, 298 and 220 from top to bottom; H: VH gene fragment

18、; L: VL gene fragment 2.2全套ScFv基因的拼接和PCR擴增將純化回收后的VH和VL基因片段,經(jīng)過定量(VH:50ng/12l,VL:50ng/20l,總體積32.5l)后,與等摩爾深度的Linker-Primer混合。經(jīng)7次重疊延伸反應(yīng),可將VH,VL基因片段隨機連接成VH-Linker-VL(SeFv)。以此為模板,再以帶有Sfi I位點的VH基因5端引物和不定期有Not I位點的JK基因3端引物,對SeFv進(jìn)行第2次PCR擴增,從而獲得全套SeFv基因,并引入了用于在pCANTAB 5E中進(jìn)行克隆的限制性內(nèi)切酶Sfi I和Not I位點。電泳結(jié)果表明720bp,3

19、50bp擴增產(chǎn)物約為左右的條帶可能為未拼接上的VH或VL基因片段(2)2 全套ScFv基因PCR擴增產(chǎn)物電泳 Fig 2 Gel electrophoresis of PCR products of repertoire ScFv gene M: pBR322/Hinf marker; , : ScFv PCR products 2.3全套ScFv基因的克隆和文庫構(gòu)建經(jīng)Sfi和Not消化后,將純化的ScFv基因克隆入pCANTAB5E載體中。以全部連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化 TG1,在氨芐青霉素選擇性固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化的菌落。在載體自連對照和無連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化菌的平皿上,均無單菌落生成;而在陽性插入對照和連

20、接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化菌平皿上,均見大量單個菌落形成。隨機挑選22個單菌落制備噬粒DNA,以EcoR和Hind雙酶切鑒定,有15個單菌落所提噬菌粒DNA切出了約為2.1kb的條帶(含有外源插段),與預(yù)測結(jié)果一致(3),表明克隆基本成功。噬菌粒文庫經(jīng)過M13KO7超感染后,產(chǎn)生的重組噬菌體顆??舍尫庞诩?xì)菌培養(yǎng)上清中,經(jīng)噬斑計數(shù),滴度為71011pfu。3 ScFv重組噬菌??寺〉拿盖需b定Fig 3 Identification of recombinant phagemid ScFv by EcoR I and Hind digestion M: DNA/Hind marker; 1-15: Product

21、s of EcoR I and Hind digestion 3討論從人或動物淋巴細(xì)胞中,用PCR擴增出全套抗體可變區(qū)基因片段,并將其插入噬菌粒載體中,構(gòu)建成全套抗體可變區(qū)基因或Fab段基因文庫。在輔助噬菌體的幫助下,將抗體分子片段展示于噬菌體表面,使抗體的表型和基因型聯(lián)系為一體5,可為利用其與固相化抗原的結(jié)合活性進(jìn)行篩選并獲得所需的抗體片段和基因,從而繞過雜交瘤技術(shù)甚至免疫過程,直接從B細(xì)胞制備抗體奠定了基礎(chǔ)。由于phage display技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,尤其是多年來人們對噬菌體分子生物學(xué)特性深入研究所構(gòu)建的多種噬菌體載體的出現(xiàn)6,使這一技術(shù)得到廣泛地應(yīng)用。但在實際應(yīng)用過程中,還存在多

22、方面的問題,需要人們加以注意,尤其在全套VH,VL基因隨機PCR拼接成ScFv方面。應(yīng)用TRIzol RNA提取系統(tǒng),可以很好地穩(wěn)定獲取總RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)得到基因組cDNA。作為全套抗體庫克隆技術(shù)的重要環(huán)節(jié),要求PCR擴增出的全套抗體V區(qū)基因能夠反映免疫球蛋白的多樣性。從理論上講,應(yīng)使其中每種V區(qū)基因都獲得擴增,這樣便可通過選用混合引物加以保證。如果構(gòu)建的文庫不夠大,將有可能篩選不到所需的抗體基因,但可通過采用高轉(zhuǎn)化率的電穿孔法加以克服。因此,構(gòu)建全套噬菌體ScFv抗體庫的第1個限速環(huán)節(jié),是在體外將VH,VL基因隨機拼接成ScFv。我們嚴(yán)格按照Pharmacia產(chǎn)品使用說明書,精確地進(jìn)行

23、了VH,VL和linker3種片段的定量,并將3種片段以等摩爾數(shù)混合進(jìn)行重疊延伸反應(yīng)。理論上應(yīng)該獲得良好的ScFvPCR產(chǎn)物,但實際操作上有很多細(xì)節(jié)值得推敲。在較長時間內(nèi),我們都未獲得理想的ScFv PCR產(chǎn)物,偶爾有1次出現(xiàn)結(jié)果,但產(chǎn)量較低且重復(fù)性不好。經(jīng)大量地比較和分析實驗,在改變了所用試劑和幾個關(guān)鍵參數(shù)后,成功地獲得了ScFv的PCR產(chǎn)物。修改后的方案穩(wěn)定性好、易于重復(fù)。另外,由于全套VH,VL基因以ScFv形式展示于噬菌體表面,從而可用于篩選抗原。而ScFv是通過重疊延伸反應(yīng)將全套VH,VL基因與Linker隨機拼接形成的,因此,隨機拼接的正確與否,直接影響到ScFv的空間構(gòu)像和讀碼框

24、架的正確性,并可直接影響下一步的親和篩選。此外,目的基因片段與噬菌粒載體的連接也是一個需要注意的環(huán)節(jié),否則會直接影響庫容及含正確基因片段克隆的數(shù)量,而增加篩選的難度。 炎癥過程中常涉及到粒細(xì)胞的增多,預(yù)先給小鼠體內(nèi)注射內(nèi)毒素或用細(xì)菌感染細(xì)胞,均可在血清中檢測出GCSF,如人和小鼠巨噬細(xì)胞用細(xì)菌內(nèi)毒素刺激后,均可產(chǎn)生GCSF7。伴隨炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生的IL1和TNF,也可刺激成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生GCSF,從而在炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)大量的中性粒細(xì)胞。因此,血清中GCSF的增多與炎癥反應(yīng)時粒細(xì)胞的聚集密切相關(guān)。由于中性粒細(xì)胞的大量增加與激活可對自身組織產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷8,9,因而細(xì)胞因子作用的雙重性應(yīng)予重視。

25、誠然,中性粒細(xì)胞的粘附和聚集是一個涉及多方面的過程,但應(yīng)用抗GCSF抗體將是維持體內(nèi)粒細(xì)胞動態(tài)平衡的途徑之一。本文庫的構(gòu)建對進(jìn)一步篩選具有中和活性的抗GCSF ScFv奠定了基礎(chǔ)。作者簡介:賈松惠,男,38歲,講師,博士西安市長樂西路17號,Tel.(029)3374551作者單位:賈松惠(第四軍醫(yī)大學(xué)病理生理學(xué)教研室,西安710032)郭鷂(第四軍醫(yī)大學(xué)防原醫(yī)學(xué)教研室,西安710032)范靈芝梁米芳侯云德(中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒基因工程國家重點實驗室)參考文獻(xiàn)1Zsebo KM, Cohen AM, Murdock DC, et al. Recombinant human granulocy

26、te colonystimulating factor; molecular and biological characterization. Immunobiol, 1986; 172:175187 2Fujishma S, Aikama N. Neutrophil mediated tissue injury and its modulation. Intension Care Med, 1995; 21:277285 3Liu M, Slutsky AS. Antiinflammatory therapies: application of molecular biology techniques in intensive care medicine. Intension Care Med, 1997; 23:718731 4Banbas CF, Kang AS, Lerner RA. Assambly of combinationrial antibody librar

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