柘木多糖和枸杞多糖對尾吊小鼠免疫功能的防護效應(yīng)

1、柘木多糖和枸杞多糖對尾吊小鼠免疫功能的防護效應(yīng)*    【摘要】  目的 研究柘木多糖和枸杞多糖對尾吊小鼠細(xì)胞免疫功能的防護作用。方法 分別以柘木多糖、枸杞多糖的高、低劑量經(jīng)口給予尾吊小鼠，MTS比色法測定脾T淋巴細(xì)胞增殖，ELISA法測定培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子分泌評價免疫功能。結(jié)果 尾吊7 d后，小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖明顯降低，細(xì)胞因子IL?2和IFN?撥梅置詡跎伲?柘木多糖能提高尾吊小鼠的脾T淋巴細(xì)胞增殖及IL?2和IFN?撥梅置凇崧? 柘木多糖對尾吊模擬微重力小鼠細(xì)胞免疫功能有一定的防護作用。 【關(guān)鍵詞】  失重模擬 尾吊 柘木多糖

2、枸杞多糖(LBP 免疫功能   Protective Effects of Cudrania Tricuspidata Polysaccharides and Lycium Barbarium Polysacharides on the Immune Function of Tail?suspended Mice.SONG Jin?ping, ZHANG Hong?yu,QU Li?na, YANG Fen, LIU Shao?fang, WANG Hong?hui,LIU Yue,XIONG Jiang?hui.Space Medicine & Medical E

3、ngineering,2007,20(6):402405    Abstract:Objective To study the protective effects of Cudrania tricuspidata polysaccharides(CPS) and Lycium barbarium polysacharides(LBP) on the cellular immune function in tail?suspended mice.Methods  Two dosages of  CPS and LBP were administ

4、rated to tail?suspended mice orally respectively. Splenic T lymphocyte proliferation were determined by MTS colorimetric assay and cytokines production in supernatants obtained from cultured spleen cells after stimulation with ConA were detected by ELISA assay. Results Splenic T lymphocyte prolifera

5、tion and the  levels  of IL?2 and IFN?撥? decreased significantly in tail?suspended mice 7 d later, which could be enhanced by administration of CPS. Conclusion CPS has protective effects on cellular immunity of tail?suspended mice which is under simulated microgravity.    Ke

6、y words:weightlessness simulation;tail?suspension;cudrania tricuspidata polysaccharides；lycium barbarum polysaccharides;immune function    Address reprint requests to:SONG Jin?ping.China Astronaut Research and Training Center.Beijing 100094,China    多糖是由單糖連接而成的多聚物，廣泛存在于

7、動物、植物和微生物中，具有較明確的抗腫瘤、提高免疫功能的作用，不同種類的多糖對于細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞(natural killer cells)功能分別有不同的激活作用1?5。柘木多糖是近年由山東大學(xué)徐譽泰教授從柘樹根中首先提取并初步研究了其免疫增強功效；枸杞是傳統(tǒng)中藥，枸杞多糖作為枸杞的有效成份，其免疫調(diào)節(jié)作用已受到廣泛研究和公認(rèn)6。    空間飛行條件下，航天員受到超重、微重力、振動、噪音、輻射、孤獨、睡眠缺失等多方面的影響，細(xì)胞免疫功能受到抑制7?9，航天員容易發(fā)生感染性疾病、潛伏病毒活化等及其并發(fā)癥，這已成為中長期飛行和星際飛

8、行的主要障礙之一，而目 前尚未找到對抗航天免疫功能下降的有效措施。為了解多糖對空間免疫效應(yīng)的干預(yù)效果，本研究用尾吊小鼠作為空間微重力的地面模擬模型，分別給予柘木多糖(CPS)和枸杞多糖(LBP)，研究這兩種多糖對尾吊小鼠免疫功能的防護作用。    方  法    藥物及主要試劑  柘木多糖由山東大學(xué)陳靠山教授實驗室制備，枸杞多糖由南通四海植物精華有限公司制備，多糖分別為用生理鹽水配至所需濃度，MTS為Promega公司產(chǎn)品，RPMI1640、ConA、PMS為Sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品。I

9、L?2、IFN?撥? ELISA試劑盒為晶美生物工程公司進口分裝產(chǎn)品。    動物分組及給藥  BALB/c小鼠，雌性，體重（20±2）g (北京維通利華實驗動物中心)。小鼠隨機分成6組，每組8只，分別為正常對照組（Con)、尾吊組(HU)、尾吊加柘木多糖分為高劑量組(HU+CPSH)1 000 mg/(kg?d)和低劑量組(HU+LBPL)500 mg/(kg?d) 、尾吊加枸杞多糖分為高劑量組（HU+LBPH)800 mg/(kg?d)和低劑量組(HU+LBPL)400 mg/(kg?d)。給藥組每天灌胃給藥0.5 mL，正常對照組、尾吊組

10、用等量生理鹽水灌胃。除正常組外，小鼠均尾部懸吊，與地面呈30°夾角。    T淋巴細(xì)胞增殖測定  常規(guī)制備小鼠脾淋巴細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液100 L, 每樣8個復(fù)孔，均分為對照孔和ConA刺激孔，ConA終濃度為5 /mL，置37, 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66 h。    MTS比色法測定T淋巴細(xì)胞增殖：每孔加MTS/PMS混合液20 L，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，在酶標(biāo)測定儀波長為492 nm處測定光密度(A)值。T淋巴細(xì)胞增殖

11、=加ConA刺激孔A值-未加ConA對照孔A值。    培養(yǎng)上清中IL?2、IFN?撥煤?量的測定  將上述濃度的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液加入48孔板，每孔1 mL，ConA刺激，終濃度為5 /mL。置37，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h和72 h，取培養(yǎng)上清離心后，-70分裝凍存。48 h培養(yǎng)上清用于IL?2測定，72 h培養(yǎng)上清用于IFN?撥貌舛扔?ELISA法進行預(yù)實驗確定樣本的稀釋倍數(shù)，再進行樣本的正式測定。    統(tǒng)計分析  文中數(shù)據(jù)均以x±sx表示，采用SPSS11.5軟件處理數(shù)據(jù)，用單因素

12、方差(one?way ANOVA)檢驗，以P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)  果    HT5H多糖對尾吊小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響  從圖1中看出，經(jīng)7 d尾吊后，小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖較對照明顯下降(P<0.05)，柘木多糖和枸杞多糖的高、低劑量組均能提高尾吊小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖，其中尾吊+柘木多糖高、低劑量組與尾吊小鼠組相比有顯著性差異(P<0.05)。    多糖對尾吊小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL?2的影響  如圖2所示，經(jīng)7 d尾吊后，小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞分泌IL?2能力較對照顯著下降(

13、P<0.01)，柘木多糖低劑量與枸杞多糖高劑量均能提高尾吊小鼠T淋巴細(xì)胞IL?2分泌水平(P<0.05)。與尾吊組相比有顯著性差異(P<0.01)。百事通     討  論    空間飛行對機體免疫功能的影響主要是對細(xì)胞免疫功能的抑制，細(xì)胞免疫功能在機體免疫功能中起中心作用。T淋巴細(xì)胞增殖是細(xì)胞免疫功能的主要指標(biāo)，即在外來免疫原或絲裂原的刺激下，淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖，產(chǎn)生功能細(xì)胞因子，對多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生激活促進作用，從而對外來病原體和自身變異細(xì)胞起到殺滅或抑制作用，反映機體在受到外來病原體或內(nèi)在變異因子侵襲時淋

14、巴細(xì)胞的反應(yīng)能力。細(xì)胞因子IL?2和IFN?撥檬怯杉畹?T淋巴細(xì)胞（Th1細(xì)胞）分泌的功能因子，是T淋巴細(xì)胞功能的另一項重要指標(biāo)。其中IL?2是促進T淋巴細(xì)胞增殖的重要因子，能上調(diào)高親和度IL?2受體的表達，IL?2與高親和力IL?2受體的結(jié)合導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞分裂。IFN?撥媚艽俳?T淋巴細(xì)胞的增殖和功能的實現(xiàn)，并對其它免疫細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)作用，如促進NK細(xì)胞增殖和殺傷功能，誘導(dǎo)和提高LAK和CTL殺瘤活性及其相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。    尾吊是地面嚙齒動物模擬失重的有效模型10，研究表明，尾吊抑制了嚙齒動物的免疫反應(yīng)，削弱其抗感染能力11?13。本研究中，尾吊7 d

15、后，小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖較對照明顯下降，T淋巴細(xì)胞分泌的功能細(xì)胞因子IL?2和IFN?撥孟陸擔(dān)?與Aviles研究結(jié)果有所不同12，可能是由于所用小鼠種屬不同，免疫反應(yīng)有一定差異。同時，本研究中，尾吊小鼠胸腺明顯萎縮，胸腺重量顯著下降（數(shù)據(jù)未顯示），提示免疫功能的抑制與應(yīng)激引起的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)有關(guān)。    柘樹是一種傳統(tǒng)抗癌中草藥。徐譽泰發(fā)現(xiàn)柘樹根水煎劑的主要有效成分為多糖和黃酮類化合物，并首次從柘木根中提取出柘木多糖，該多糖對小鼠S180腫瘤的抑制率達57，同時發(fā)現(xiàn)腹腔給藥能明顯提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞過氧化物酶的活性、吞噬功能及細(xì)胞毒活性，認(rèn)為柘木多糖通過調(diào)節(jié)機

16、體的免疫功能而起到抗腫瘤作用1。我們在前期實驗中首次觀察了該多糖的體外免疫調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明：柘木多糖進一步分離純化出的3種多糖，體外能直接刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，協(xié)同ConA增強脾淋巴細(xì)胞增殖，并促進小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的?資曬埽?表明柘木多糖對免疫細(xì)胞有直接激活作用，免疫細(xì)胞膜上可能存在此類多糖受體14。在本實驗中，進一步研究了柘木多糖對在體細(xì)胞免疫功能的作用，并與已經(jīng)廣泛研究、公認(rèn)具有良好免疫調(diào)節(jié)作用的同類物質(zhì)枸杞多糖相比較。    從本實驗看出，500 mg/kg和1 000 mg/kg劑量柘木多糖灌胃給藥對尾吊小鼠引起的T淋巴細(xì)胞增殖功能下降均有防護作用，高

17、劑量組較低劑量組效果更佳。同時，低劑量組能增加Th1細(xì)胞IL?2分泌水平，高劑量組則對Th1細(xì)胞分泌IFN?撥糜邢災(zāi)?促進作用。多糖不同劑量對細(xì)胞免疫功能各指標(biāo)的保護作用并不完全一致，可能是因為多糖對免疫細(xì)胞的效應(yīng)存在幾種不同的作用途徑。    枸杞為茄科植物的成熟果實,微寒無毒性,味甘平,是我國名貴中藥。中國藥典記載枸杞子有滋腎益精、明目之效。枸杞多糖是從傳統(tǒng)中藥枸杞子中提取的有效成份，免疫增強作用是其主要藥理作用。研究表明枸杞多糖能使正常小鼠外周白細(xì)胞數(shù)目增加，提高免疫抑制小鼠Th細(xì)胞的數(shù)量，提高Th/Ts比值，增強T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及NK細(xì)胞的殺傷活性2?3。在

18、本實驗中，枸杞多糖對尾吊小鼠引起的細(xì)胞免疫功能下降也有一定的提升趨勢，但效果不及柘木多糖。    本次實驗還表明，兩種多糖對尾吊引起的胸腺萎縮沒有防護作用（數(shù)據(jù)未顯示），表明多糖并沒有阻斷應(yīng)激引起的免疫效應(yīng)，多糖對尾吊小鼠免疫功能的防護可能與多糖對免疫細(xì)胞的直接激活作用有關(guān)。    Aviles12的研究也表明，從蘑菇擔(dān)子菌中提取活性糖相關(guān)復(fù)合物(AHCC)能增強尾吊小鼠的免疫功能。可增加脾細(xì)胞分泌IL?2和IFN?撥茫?但對脾細(xì)胞增殖無影響，表明AHCC能減輕尾吊模型對免疫的不良效應(yīng)，與我們的結(jié)果有相同趨勢。  

19、  多糖屬天然產(chǎn)物，對機體毒性低或無毒性，柘木多糖是山東大學(xué)近年來新提取的植物多糖，現(xiàn)由我室和山東大學(xué)聯(lián)合研發(fā)，本研究首次觀察了它對在體細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用，并首次將它用于航天免疫研究中，表明該多糖能顯著提升模擬失重引起的細(xì)胞免疫功能下降，并優(yōu)于傳統(tǒng)的枸杞多糖，在未來中長期空間飛行航天員免疫調(diào)節(jié)藥物中具有潛力和優(yōu)勢。    （致謝：本課題中所用柘木多糖由山東大學(xué)生命科學(xué)院陳靠山教授提供，在此表示衷心的感謝。）【參考文獻】  1 GONG Lihua,WANG Haixia,WANG Xianlie,et al. The effect of C

20、udrapolysaccharide on peritoneal macrophage activity in mice and its tumor inhibitioin actionJ.J of Shandong University of TCM, 2002,25(2):145?146.2 LIU Yanping,MAO Huiqing,LI Ping. The effect of Lycium barbarum polysaccharide on T lymphocyte subset and lymphocyte transformation in miceJ.J of Qingha

21、i Medical College, 2000,21(4):4?5.3 LI Jidong,LIU Yanping.The immune regulation effects of Lycium barbarum polysaccharide on NK and leukocyte in miceJ. J of Qinghai Medical College, 2001,22(1):1?2.4 DA Sliva BP,Parente JP.An anti?inflammatory and immunomodulatory polysaccharide from Orbignya phalera

22、taJ.Fitoterapia,2001,72(8):887?893.5 Mizuno T,Yeohlui P,Kinoshita T,et al. Antitumor activity and chemical modification of polysaccharides from niohshimeji mushroom, Tricholma giganteum.J.Biosci Biotechnol Biochem, 1996,60(1):30?33.6 LI Yingjie,QI Chunhui,ZHANG Yongxiang.Advance in study of immunomo

23、dulation mechanism of Lycium barbarum polysaccharideJ.Chinese J of New Drugs,2004,13(10):882?886.7 Sonnenfeld G,Butel JS, Shearer WT. Effects of the space flight environment on the immune systemJ. Rev Environ Health, 2003,18(1):1?17.8 Mills PJ, Meck JV, Waters WW, et al. Peripheral leukocyte subpopu

24、lations and catecholamine levels in astronauts as a function of mission durationJ. Psychosom Med,2001,63(6):886?890.9 Konstantinova IV,Rykova MP,Lesnyak AT,et al.Immune changes during long?duration missionsJ. J Leu Biol,1993,54(3):189?201.10 Adams GR,Caiozzo VJ,Baldwin KM.Skeletal muscle unweighting:spaceflight and ground?based modelsJ.J Appl Physiol, 2003