基于光譜識(shí)別模式結(jié)合RP-HPLC法測(cè)定葛根芩連片中黃芩苷的含量

1、基于光譜識(shí)別模式結(jié)合RP-HPLC法測(cè)定葛根芩連片中黃芩苷的含量 11-05-18 11:21:00 作者：肖靜，張振巍編輯：studa20【摘要】 目的 建立RP-HPLC對(duì)葛根芩連片中黃芩苷含量測(cè)定方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(Stable Bond Analytical 4.6250mm，5m)，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水(50：50)，流速為1.0ml/min，柱溫30，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。結(jié)果 操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，平均回收率為96.48%。結(jié)論 本法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于葛根芩連片中黃芩苷含量的測(cè)定方法。 【關(guān)鍵詞】

2、葛根芩連片;黃芩苷;RP-HPLCAbstractObjective To set up a method for determining the content of baicalin in Gegen Qinlian Tablets with HPLC.Methods Chromatography was performed on a Agilent ZORBAX SB-C18(Stable Bond Analytical 4.6250mm，5m),with a mixture of methanol-0.2% phosphoric acid(50:50) as the mobile ph

3、ase.The detection wavelength was 280nm ,and the column temperature was maintaned at 30,and the flow rate was 1.0ml/min.Results The mean value of recovery rate is 96.48%.Conclusion This methed was shown to be simple, accurate, with a good reproducibility and could therefore be used for the quality co

4、ntrol for Gegen Qinlian Tablets.Key words Gegen Qinlian Tablets;Baicalin;RP-HPLC葛根芩連片是由葛根、黃芩、黃連、炙甘草四味中藥材組成的中成藥制劑，具有解肌清熱、止瀉止痢的功效，用于濕熱蘊(yùn)結(jié)所致的泄瀉、痢疾等癥1。其中黃芩為該中成藥中的君藥，故在質(zhì)量控制時(shí)選用測(cè)量黃芩中主要有效成分黃芩苷的含量。本文采用HPLC方法對(duì)葛根芩連片中的黃芩苷進(jìn)行了含量測(cè)定，獲得較為滿意的效果，并結(jié)合PDA檢測(cè)器對(duì)樣品中黃芩苷色譜峰的光譜純度進(jìn)行了有效的定性。1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 儀器Waters 2695高效液相色譜儀(Waters2996

5、二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站)，超聲波清洗器(KQ2200DB，40kHz，80W，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);混合纖維素酯微孔濾膜(孔徑：0.45m)，電子分析天平(Sartorius BS 224 S), SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。1.2 試劑與材料甲醇(色譜純，20070315112)，乙醇(分析純，20070827093)，黃芩苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供(批號(hào)110715-200212，供含量測(cè)定使用)，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。葛根芩連片(河南禹州市藥王制藥有限公司，批號(hào)分別為081005、081010、081012)。2

6、方法與結(jié)果2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察Agilent ZORBAX SB-C18 (Stable Bond Analytical 4.6250mm，5m)色譜柱;流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水(50：50)，流速：1ml /min，柱溫30，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，在此色譜條件下，理論塔板數(shù)大于7000，分離度大于1.5，進(jìn)樣量為10l。2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.483mg/ml的黃芩苷對(duì)照品溶液。2.3 供試品溶液的制備取供試品10片，研細(xì)，混勻，精密稱取相當(dāng)于平均每片的樣品重量，置50ml容量瓶中，精密加入7

7、0%乙醇50ml，搖勻，稱定重量，超聲處理(功率200W，頻率50Hz)30min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)0.45m微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。以上所配溶液的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。圖1 樣品HPLC色譜圖黃芩苷對(duì)照品(A)、供試品(B)及陰性樣品、(C)HPLC色譜圖光譜純度分析及樣品中黃芩苷色譜峰定位分析：選擇與黃芩苷對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的色譜峰進(jìn)行光學(xué)純度分析，以保證此色譜峰的光譜純度較高，沒(méi)有共流物的出現(xiàn)。PDA光譜純度分析設(shè)定波長(zhǎng)為210400nm全波段掃描。由以上四個(gè)光譜純度分析圖上可以看出：在供試品11.050min的色譜峰位置與黃芩苷對(duì)照品光譜有較大

8、相似，如圖2、圖3;將兩者光譜重疊得到PDA光譜區(qū)別圖(如圖4)，由圖4中可以看出，區(qū)別曲線在0.000范圍內(nèi)波動(dòng)較小，并且由PDA數(shù)據(jù)校正產(chǎn)生純度與閾值角度上來(lái)看 (如圖5) ，PDA光譜匹配角度為0.678，PDA匹配的閾值角度為1.272，光譜匹配角度色譜純度角，說(shuō)明該色譜峰的光譜純度較高，沒(méi)有光譜共流物的出現(xiàn)，可以作為樣品中黃芩苷進(jìn)行定量分析。 11-05-18 11:21:00 作者：肖靜，張振巍編輯：studa202.4 線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下的黃芩苷對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分別置于25ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成系列濃度

9、的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜，以峰面積為縱坐標(biāo)，以黃芩苷濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得線性回歸方程為Y=2.82104X9.24104，r =0.9998(n=5),結(jié)果表明在19.3296.60g/ml范圍內(nèi)與黃芩苷的峰面積呈良好的線性關(guān)系。圖2 黃芩苷對(duì)照品PDA光譜圖圖3 供試品在11.050min色譜的光譜圖圖4 對(duì)照品與供試品PDA光譜區(qū)別圖圖5 PDA光譜純度分析圖2.5 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液10l，重復(fù)進(jìn)樣5次，并進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定其RSD為0.75%，表明精密度良好。2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10l

10、，立即進(jìn)樣，分別于0、4、8、16、24、48、72h進(jìn)樣，測(cè)定其RSD值為0.83%(n=6)，結(jié)果表明，供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.7 重復(fù)性試驗(yàn)按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，制備5份供試液，精密吸取供試品溶液10l，并進(jìn)行測(cè)定，RSD為0.91%(n=5)，說(shuō)明供試品溶液的重復(fù)性良好。2.8 加樣回收試驗(yàn)取葛根芩連片(批號(hào) 081012)10片，按照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，制備同時(shí)加入適量對(duì)照品溶液，用70%乙醇稀釋至刻度，再取0.5ml此溶液至10ml容量瓶中，加入甲醇定容，進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜，計(jì)算其RSD=0.62%(n=6)，其結(jié)果見(jiàn)表1。表1

11、 加樣回收率實(shí)驗(yàn)2.9 黃芩苷的含量測(cè)定取3個(gè)不同批號(hào)的葛根芩連片按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10l，測(cè)定(n=3)，取三次測(cè)定平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。3 討論3.1 2010版藥典對(duì)黃芩供試品制備采用回流提取，本實(shí)驗(yàn)供試品制備采用超聲提取方法，采用3批葛根芩連片分別制備供試品，結(jié)果顯示黃芩苷含量符合藥典要求，超聲提取方便、節(jié)約時(shí)間，提取效率高，適合于黃芩樣品供試品的制備。表2 3批樣品的含量測(cè)定結(jié)果3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定經(jīng)過(guò)檢測(cè)器在200400nm波長(zhǎng)段掃描紫外吸收光譜圖，發(fā)現(xiàn)黃芩苷在280nm和317nm處有兩個(gè)吸收峰，由于在280nm處為最大特征吸收峰，因此選擇280nm處為黃芩苷的測(cè)定波長(zhǎng)。3.3 流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)曾選用甲醇-水-磷酸(47:53:0.2)、甲醇-0.2%磷酸水(50：50)、乙腈-0.02%磷酸(47:53)