B細(xì)胞淋巴瘤SHP-1基因甲基化狀態(tài)及其意義

1、B細(xì)胞淋巴瘤SHP-1基因甲基化狀態(tài)及其意義 作者：汪清銘， 吳祥元， 王東寧， 林曲， 董敏， 溫景蕓【摘要】 【目的】探討JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控子SHP-1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島異常甲基化在B細(xì)胞淋巴瘤中的意義。【方法】 收集存檔石蠟包埋組織標(biāo)本61例（52例B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤標(biāo)本，9例良性增生淋巴結(jié)標(biāo)本），健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA標(biāo)本15例，用甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR,MSP）和非甲基化特異性PCR（unmethylation-specific PCR,un-MSP）檢測(cè)SHP-1啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)，MSP、un-M

2、SP和RT-PCR方法分別檢測(cè)接受或未接受去甲基化處理的Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Raji的甲基化狀態(tài)及mRNA的表達(dá)， MTT法檢測(cè)接受去甲基化干預(yù)后細(xì)胞生長受抑情況。【結(jié)果】 SHP-1基因啟動(dòng)子區(qū)域在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤甲基化頻率分別為94及97，對(duì)照組9例淋巴結(jié)良性增生標(biāo)本和15例正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本中SHP-1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化頻率為0。經(jīng)去甲基化干預(yù)后，Raji細(xì)胞SHP-1基因啟動(dòng)子區(qū)域呈去甲基化狀態(tài)，基因恢復(fù)表達(dá)，細(xì)胞生長受到抑制。【結(jié)論】 SHP-1基因啟動(dòng)子區(qū)域啟動(dòng)子區(qū)域CpG島在B細(xì)胞淋巴瘤中存在高度甲基化，由其所致的SHP-1基因沉默可能是B細(xì)胞淋

3、巴瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素，SHP-1基因的甲基化可作為一個(gè)良好的分子診斷標(biāo)記及可能的治療靶點(diǎn)。 【關(guān)鍵詞】 淋巴瘤； SHP-1； 甲基化 Abstract: 【Objective】 To investigate the methylation state of CpG island in the SHP-1 gene promoter which is one of the negative regulators of JAK/STAT signaling pathway and to evaluate its significance in B-cell lymphoma. 【Methods

4、】 Sixty-one paraffin specimens including 52 specimens of B-cell non-Hodgkin lymphoma and 9 specimens of benign lymphnodes proliferation and 15 specimens of blood mononuclear cells from health individuals were studied, methylation state of CpG island in SHP-1 gene in the specimens and Raji cell line

5、were detected by methylation specific PCR(MSP) and unmethylation-specific PCR(un-MSP). The expression level of SHP-1 in Raji cells with or without 5-aza-2-deoxyoytidine treatment were detected by reverse transcriptase PCR(RT-PCR).The inhibitory ratio of Raji cells were measured by MTT assay. 【Result

6、s】 The frequency of methylation in SHP-1 gene promoter in large B-cell lymphoma(DLBCL) and follicular lymphoma(FL) were 94% and 97%,respectively.In control group, however,9 specimens of benign lymphnodes proliferation and 15 specimens of blood mononuclear cells from health individuals showed no meth

7、ylation in CpG island of SHP-1 gene promotor（P 0.0001）. The expression of SHP-1 was recovered and the cell growth was inhibited when the cell exposed to the demethylating reagent. 【Conclusion】 SHP-1 gene silencling with aberrant CpG methylation is probably one of the critical events to the onset of

8、B-cell lymphoma as well as important implications for the diagnostic markers and the target of gene therapy. Key words: lymphoma; SHP-1; methylation J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(1): 92-96 SHP-1是一種天然存在于胞漿內(nèi)的酪氨酸磷酸酶，其通過催化受體相關(guān)酪氨酸激酶（Janus Kinase, JAKs）去磷酸化導(dǎo)致JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer

9、 and activator of transcription)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活性下調(diào)，是JAK/STAT途徑主要負(fù)調(diào)控子之一，可對(duì)抗蛋白酪氨酸激酶的潛在促生長和致癌活性，因此，近年來有學(xué)者認(rèn)為其可能是候選的抑癌基因1。研究表明，基因啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化可導(dǎo)致基因沉默，抑癌基因的甲基化及由其所導(dǎo)致的抑癌基因失表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究檢測(cè)B細(xì)胞惡性淋巴瘤中SHP-1基因的甲基化狀態(tài)，并對(duì)Raji細(xì)胞系進(jìn)行去甲基化干預(yù)，觀察腫瘤細(xì)胞SHP-1基因表達(dá)情況及其生長狀態(tài)的改變，探討SHP-1基因甲基化在B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的意義，為B細(xì)胞淋巴瘤的診斷和治療提供新的方向。 1 材料和方法 1.1

10、細(xì)胞系與病例 Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Raji由中山大學(xué)腫瘤防治中心饋贈(zèng)。52例B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤標(biāo)本為本院1999年2005年間存檔石蠟標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織形態(tài)學(xué)及免疫組化確診。濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L）35例，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）17例，男33例，女19例，年齡1872歲，平均45.6歲。9例良性非特異性慢性淋巴結(jié)炎石蠟包埋組織標(biāo)本和15例健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cells ，PBMC）標(biāo)本作為對(duì)照組。 1.2 試 劑

11、 UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒、Trizol購自上海生工生物工程公司，TaKaRa Genome-DNA Extraction Kit為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，Wizard DNA Clean-up system、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶為美國Promega公司產(chǎn)品，MSP陽性對(duì)照CpGenome Universal Methylated DNA 購自美國Chemicon公司。 1.3 DNA的提取 用UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒提取石蠟組織DNA，TaKaRa Genome-DNA Extraction Kit用于細(xì)胞系基因組DNA的提取，紫外分光光度儀確定DNA含量及純度

12、。 1.4 甲基化特異性PCR和非甲基化特異性PCR分析 1.4.1 亞硫酸氫鈉修飾DNA DNA1.5 ?滋g，三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液調(diào)整體積至50 ?滋L，加新鮮配制的3 mol/L NaOH（終濃度0.3 mol/L） 37 15 min使DNA變性,向已變性的DNA中加入520 ?滋L 3.6 mol/L亞硫酸氫鈉和30 ?滋L 10 mmol/L氫醌， 55 避光水浴16 h。然后用Wizard DNA Clean-up system 純化DNA,最后用3 mol/L NaOH,3 mol/L醋酸氨進(jìn)行亞硫酸氫鈉后處理，乙醇沉淀DNA,溶解于50 ?滋L 三羥甲基氨基甲

13、烷-乙二胺四乙酸緩沖液中，-20避光保存?zhèn)溆谩?1.4.2 PCR擴(kuò)增 SHP-1基因甲基化引物:上游:5-GAA CGT TAT TAT AGT ATA GCG TTC-3 (nt:6857-6880);下游:5-TCA CGC ATA CGA ACC CAA ACG-3(nt:7015-6995);擴(kuò)增產(chǎn)物長度:159 bp。擴(kuò)增條件：94 預(yù)變性12 min， 55 退火， 35個(gè)循環(huán)。SHP-1基因非甲基化引物:上游：5-GTG AAT GTT ATT ATA GTA TAG TGT TTG G-3(nt:6855-6882);下游：5-TTC ACA CAT ACA AAC CCA

14、AAC AAT-3(nt:7016-6993);擴(kuò)增產(chǎn)物長度:162 bp。擴(kuò)增條件：94 預(yù)變性12 min， 58 退火， 35個(gè)循環(huán)。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外光凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。 1.5 去甲基化干預(yù) 用含100 L/L胎牛血清的R?妝?賺?磚1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)Raji細(xì)胞，細(xì)胞按5104 /mL起始濃度培養(yǎng)于去甲基化試劑5-aza-2，-deoxyoytidine終濃度為1 ?滋mol/L的培養(yǎng)液中，每天更換培養(yǎng)液及去甲基化試劑，以未加去甲基化試劑的細(xì)胞為對(duì)照，培養(yǎng)第3天后提取DNA,第3、5天后提取RNA,觀察基因甲基化狀態(tài)及表達(dá)。 1.6 RT-PCR Trizol提取Raji細(xì)胞總RNA,用隨機(jī)引物、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶等合成cDNA，按試劑說明書進(jìn)行操作。SHP-1引物：上游：5-GAC TGT GAC ATT GAC ATC CAG-3;下游：5-CTT