醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)試驗(yàn)講義(共20頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)講義浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)課程組2012年9月3日實(shí)驗(yàn)一 人類外周血染色體標(biāo)本制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)了解和掌握人類外周血染色體標(biāo)本培養(yǎng)和制備的基本方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理正常情況下，外周血中的小淋巴細(xì)胞，幾乎都處在G1期或G0期，外周血細(xì)胞中是沒有分裂相的。1960年，Nowell和Morhead證實(shí)，外周血中的小淋巴細(xì)胞可以在植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）或其它有絲分裂刺激劑的影響下，在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞，在培養(yǎng)中進(jìn)行有絲分裂。這樣經(jīng)過短期培養(yǎng)（colchicine），秋水仙素的處理，低滲和固定，就可以迅速而又簡便地獲

2、得體外生長的細(xì)胞群體和有絲分裂相。本方法已為臨床醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、遺傳毒理學(xué)等方面廣泛應(yīng)用。 三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)材料人外周血 （淋巴細(xì)胞） 實(shí)驗(yàn)器具離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、培養(yǎng)瓶、刻度離心管、注射器和針頭（6 1/2號）、吸管、量筒、火柴、酒精燈、pH計(jì)、研缽、飯盒、超凈工作臺、鑷子、載玻片、玻片盒、燒杯、染缸、試管架、玻璃鉛筆或記號筆、顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙等。 藥品和試劑 1培養(yǎng)液的配制 RPMI1640培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉) 80% 小牛血清(56水浴滅活30分鐘，滅活可破壞補(bǔ)體及一些污染的病毒) 20% 植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白質(zhì),可用培養(yǎng)基溶

3、解) 4% 青霉素終濃度 100U/ml 鏈霉素終濃度 100U/ml用3.5%NaHCO3調(diào)pH7.07.2，用玻璃濾器，抽濾滅菌。在超凈工作臺，分裝到培養(yǎng)瓶中（每瓶含培養(yǎng)基5 ml）。培養(yǎng)液置于-20冰箱保存。使用前從冰箱中取出，溫育至37。2肝素濃度為0.2%，作為抗凝劑使用。200 mg肝素粉末溶于100 ml生理鹽水中。高壓滅菌，-4冰箱保存?zhèn)溆谩?3KCl濃度為0.075 M，0.559 g氯化鉀溶于100 ml雙蒸水中。氯化鉀作為低滲液的優(yōu)點(diǎn)是染色體輪廓清楚，可染性增強(qiáng)，時間縮短。4秋水仙素10 mg/ml，作為有絲分裂的阻止劑，抑制細(xì)胞分裂時紡錘體形成，使細(xì)胞分裂停止在中期。稱

4、取10 mg秋水仙素溶于100 ml生理鹽水中，配成100 mg/ml的原液，分裝小瓶，高壓滅菌，-20冰箱保存?zhèn)溆?。臨用時取上述原液用生理鹽水稀釋成10 mg/ml。5甲醇 6冰醋酸 7吉姆沙(Giemsa)染液 吉姆沙原液：先將0.5g吉姆沙粉末干研磨，時間越長越好；加33 ml 60預(yù)熱的純甘油，在研缽中研磨，放在60恒溫水浴中保溫90分鐘。冷卻后，再加入33 ml甲醇，充分?jǐn)嚢瑁脼V紙過濾，收集在棕色瓶中保存，作為原液。原液要提前半年配制。原液中按比例加入磷酸緩沖液即可染染色體標(biāo)本。 1份Giemsa原液9份磷酸緩沖液 8磷酸緩沖液(pH 6.8) 溶液A：磷酸二氫鉀 (KH2PO4.

5、2H2O) 9.078 g溶于1000ml蒸餾水中。溶液B：磷酸氫二鈉 (Na2HPO4.2H2O) 11.876 g溶于1000ml蒸餾水中。100ml緩沖液：需溶液A50.8 ml，溶液B 49.2 ml。 四、實(shí)驗(yàn)步驟1采血 先在供血者肘部用酒精棉球消毒，取2 ml干燥滅菌注射器，配上針頭（6 1/2號）并吸取肝素液0.2 ml濕潤針筒，采靜脈血2 ml，轉(zhuǎn)動針筒使血與肝素混勻。2培養(yǎng)采血完畢立即將針頭插入含RPMI 1640培養(yǎng)瓶內(nèi)（瓶蓋預(yù)先用酒精棉球消毒），每瓶滴入30滴血，搖勻。2 ml血可分裝三至四瓶。置37 ± 0.5恒溫中培養(yǎng)72小時，其間可搖動23次。3秋水仙素(

6、colchicine)處理在終止培養(yǎng)前23小時，加入秋水仙素，6 1/2號針頭3滴（每ml約60滴），使細(xì)胞分裂終止在中期。秋水仙素的濃度不宜過高和作用時間過長，雖然這樣做可以得到較多的分裂相，但導(dǎo)致染色體過分縮短，不宜用于顯帶分析。4離心 將培養(yǎng)物倒入刻度離心管內(nèi)，以1000rpm離心10分鐘，棄去上清液，留底層沉淀物并用吸管打勻。 5低滲處理 加8 ml預(yù)溫(37)的0.075 M KCl低滲液，用吸管打勻使細(xì)胞懸浮于低滲液中，37水浴箱靜止2530分鐘，使白細(xì)胞膨脹，染色體分散，紅細(xì)胞解體。低滲處理的效果與低滲的成分、處理的時間和溫度有關(guān)。這是比較關(guān)鍵的一步，對任一組織和低滲液都要事先進(jìn)

7、行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定最合適的處理時間。6預(yù)固定 在低滲2530分鐘后，加新配置的固定劑（甲醇:冰醋酸，3:1 ）1ml，打勻。這樣有助于細(xì)胞的均勻懸浮而不團(tuán)聚凝塊和防止細(xì)胞丟失。甲醇和冰醋酸要現(xiàn)配現(xiàn)用，如放置時間較長，即不宜再用，以免影響固定效果。 7再離心 1000 rpm離心10分鐘，棄去上清液，留沉淀物。 8固定 沿離心管壁加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，3:1）至5ml，將沉淀物打勻，固定1525分鐘。 9再離心 1000 rpm離心10分鐘，棄去上清液。 10再固定： 加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，1:3）至5 ml打勻，固定 1525分鐘。 11再離心 1000 rpm離心10分

8、鐘，棄去上清液。 12再固定 加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，1:1）至5 ml打勻，固定 1525分鐘，或冰箱中放置數(shù)小時，也可以過夜。13制片經(jīng)上述固定后，1000 rpm離心留下約0.3 ml沉淀物，打勻。用吸管吸取細(xì)胞懸液，滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立即用嘴吹散，在酒精燈焰上通過幾次，使細(xì)胞平鋪于載玻片上，空氣干燥（或用電吹風(fēng)吹干）。14染色用Giemsa染液染色8分鐘，玻片用自來水沖洗，晾干。 15鏡檢 將染色后的玻片先用低倍鏡全面檢查，找到良好的分裂相，換用高倍鏡、油鏡觀察分析。五、注意事項(xiàng)1在采血接種培養(yǎng)時，注意不要加入太多的肝素。肝素過多時可能引起溶血和抑制淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)

9、化和分裂；但肝素也不能過少，以免發(fā)生凝血現(xiàn)象。2培養(yǎng)基中不含L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，則溶解有RPMI 1640培養(yǎng)基的液體可先用濃鹽酸調(diào)pH4.0，然后高壓滅菌（注意121，0.15 MPa，滅菌15分鐘）。冷卻后，再加入L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、PHA、滅活小牛血清和雙抗，再調(diào)pH7.0，分裝備用。L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉用微孔濾膜過濾滅菌，不能高壓滅菌。3接種的血樣愈新鮮愈好，最好在24小時內(nèi)培養(yǎng)。如果不能立刻培養(yǎng)，應(yīng)置于4冰箱，保存時間過久會影響細(xì)胞活力。4溫度和培養(yǎng)液的酸堿度十分重要。人的外周血中淋巴細(xì)胞培養(yǎng)最適溫度為37±0.5，溫度過高過低都將影響細(xì)胞的生長，但細(xì)胞對低溫比對

10、高溫耐受力強(qiáng)；若是中途停電，可相應(yīng)延長培養(yǎng)時間。培養(yǎng)液的最適pH7.27.4，偏酸，細(xì)胞發(fā)育不良；偏堿，細(xì)胞會出現(xiàn)輕度固縮。5PHA的質(zhì)量和濃度是培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵問題。PHA如果保存時間太長，效價(jià)會降低，應(yīng)在培養(yǎng)基中多加一些。6培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集可輕輕震蕩，使凝集塊散開，繼續(xù)培養(yǎng)。7最好使用水平式離心機(jī)，離心速度不易過高，否則沉降在管底的細(xì)胞團(tuán)不易打散；反之，離心速度太低，細(xì)胞會丟失。8培養(yǎng)失敗的可能原因（1） 培養(yǎng)瓶等器材洗滌不合要求。（2） 配制培養(yǎng)液使用的二或三蒸水不合要求。（3） PHA和培養(yǎng)基存放時間過長。（4） 無菌操作不符合要求，發(fā)生細(xì)菌污染。9標(biāo)本質(zhì)量不佳的原因（1） 秋

11、水仙素處理不當(dāng)。 秋水仙素的濃度、處理時間不夠，結(jié)果分裂相少；如果秋水仙素的濃度過高、處理時間過長，則使染色體過于縮短，難以進(jìn)行分析。工作時，需要摸索處理時間和濃度。（2） 低滲處理不當(dāng)。低滲時間過長時，細(xì)胞膜往往過早破裂，導(dǎo)致分裂細(xì)胞丟失或染色體丟失；低滲處理時間不足時，細(xì)胞膨脹不夠，染色體分散不佳，難以進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和分析。低滲時間的掌握與氣溫有關(guān)。（3） 離心速度不合適。如果從培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞進(jìn)行離心時的速度太低，細(xì)胞丟失；如低滲后離心速度過高，則往往分裂細(xì)胞過早破裂，分散良好的分裂相多被丟失。（4） 固定不充分。如固定液不新鮮，染色體形象模糊，呈毛刷狀，染色體周圍有胞漿背景。因此，固定液

12、純度要高，臨用時新鮮配制。六、作業(yè)選擇觀察10個較好的細(xì)胞分裂相，計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。 附 染色體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)和染色體制片過程中所用的培養(yǎng)瓶等玻璃器材和橡皮塞等在使用前，都要經(jīng)過嚴(yán)格的洗刷、浸泡、蒸餾水洗和滅菌等過程，以保證清潔無菌。一、器材的清洗 1清洗液的配制重鉻酸鉀 120g 濃硫酸 160ml 蒸餾水 1000ml先將重鉻酸鉀倒入蒸餾水中，然后慢慢加入濃硫酸，邊加入邊用玻璃棒攪拌。由于加入濃硫酸時會產(chǎn)生高溫，所以不能用玻璃容器，而可用塑料桶或陶瓷缸。配制好的清潔液，應(yīng)儲存在有蓋的容器內(nèi)。如清潔液已呈綠黑色時，表明已經(jīng)失效，不能再用。硫酸的腐蝕性強(qiáng)，操作時要戴防護(hù)手套，不能用金

13、屬鑷子去夾玻璃瓶等。2一般玻璃器皿的處理玻璃器皿先用自來水洗去贓物，用肥皂液煮沸30分鐘后，趁熱刷洗干凈，用自來水沖洗去掉肥皂殘跡，空氣干燥。放入清潔液中浸泡1天，然后取出，自來水充分沖洗，在蒸餾水中浸泡一天，再換一次蒸餾水，浸泡一天。置80 烤箱中烘干。用牛皮紙包扎瓶口，干熱滅菌150 2小時。3玻璃細(xì)菌濾器的處理新購濾器用自來水刷洗后，裝上新配洗滌液（化學(xué)純濃硫酸6ml，化學(xué)純硝酸鈉2g，蒸餾水100 ml），讓其自然濾過，然后用自來水、蒸餾水反復(fù)濾過，接著用1M的NaOH溶液過濾至液體呈中性?？諝飧稍?，用牛皮紙或玻璃紙包好，高壓滅菌。用過的濾器必須立即進(jìn)行清洗，先在清潔液中浸泡一天，然后

14、自來水沖洗，蒸餾水浸泡一天，蒸餾水抽濾多次，使堵塞濾孔的物質(zhì)完全除去。4橡膠類制品的處理新橡膠類制品用水刷洗后，用2%的NaOH溶液煮沸20分鐘，然后用自來水沖洗，用2%的HCl溶液煮沸20分鐘，自來水洗，蒸餾水中浸泡24小時，晾干，牛皮紙包扎，高壓滅菌。用過的橡膠類制品立即泡于清水中，用肥皂液刷洗后，用自來水沖洗，蒸餾水中浸泡24小時，晾干，牛皮紙或玻璃紙包扎，高壓滅菌。5載玻片的處理將載玻片一片一片放入肥皂溶液煮沸20分鐘，刷洗干凈后，用自來水沖洗，蒸餾水中浸泡24小時，放入裝有蒸餾水的飯盒中，置冰箱中冷凍待用。二、滅菌1干熱滅菌 （dry heat sterilization）一般采用電

15、熱鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行干熱滅菌。一般玻璃和金屬器材都可使用干熱滅菌，較為方便。布類、橡皮類、液體不能用干熱滅菌。滅菌時的溫度和時間是：150干烤2小時。必須注意以下事項(xiàng)：（1） 放置入烤箱的物品，要間隔一定距離，以免影響滅菌效果。特別不要將包扎紙直接與烤箱箱壁或箱底接觸，以免在高溫下烤焦、起火。（2） 烤箱電源打開后，門上應(yīng)掛一個標(biāo)示牌，以免他人誤開箱門，使冷空氣突然進(jìn)入烤箱，造成玻璃器皿破裂。（3） 先加熱至80左右，使箱內(nèi)空氣完全排空后，再關(guān)閉氣門，150烤2小時后自然冷卻。（4） 干熱滅菌過程中，應(yīng)有專人負(fù)責(zé)照看。2高壓滅菌 (autoclaving sterilization)一般用手提式電

16、熱高壓蒸汽滅菌鍋，既經(jīng)濟(jì)又省時，效果也好，是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常采用的方法。一般玻璃器材、玻璃濾器、橡膠類制品、布類和一些溶液都可用高壓滅菌。滅菌時不要裝的太滿，液體不要裝瓶過滿，瓶塞上插上一個注射針頭，以免高壓過程中容器炸裂或瓶塞掉出。擰緊鍋蓋后，打開電源，打開排氣孔，待升溫至排氣孔排出氣流呈直線，冷空氣已基本排出時，關(guān)上排氣孔。直至氣壓達(dá)0.15 MPa后，繼續(xù)滅菌20分鐘。滅菌完畢后，關(guān)上電源，待壓力自然下降，溫度降低后再打開鍋蓋，取出物品。趁熱放入80烘箱內(nèi)烘干待用。3過濾除菌 ( filter sterilization )細(xì)胞培養(yǎng)中的常用的生物性物質(zhì)，如培養(yǎng)液、血清、酶溶液等不能用高熱或高壓

17、滅菌，只能用過濾法除菌。此外，NaHCO3等類物質(zhì)遇高熱時會發(fā)生分解，故需要用過濾法除菌。（1） 玻璃濾器 有六個型號，其中G6型濾器可以有效的除菌。玻璃濾器在高壓滅菌之后，板上將析出少量堿性物質(zhì)，所以，用它過濾后，液體的pH值將會有所增高，因此，在調(diào)配液體時應(yīng)考慮這一情況。用玻璃濾器抽濾時，抽濾不要過快，以濾液分滴濾下較為合適。注意避免液體抽干后仍在繼續(xù)抽濾。（2） 微孔濾器濾膜常用醋酸纖維薄膜，具有靈敏度高、方便、經(jīng)濟(jì)省時的優(yōu)點(diǎn)。濾器的后方接一個5ml的注射器。濾膜可以耐高壓滅菌，0.2 mm孔徑的內(nèi)膜的除菌效果即與G6型玻璃濾器相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)二 人類染色體核型分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)掌握染色

18、體核型分析的常用方法以及G帶的帶型特征和識別技巧，初步學(xué)會識別G帶染色體。二、實(shí)驗(yàn)原理 將一個細(xì)胞內(nèi)的染色體按照一定的順序排列起來構(gòu)成的圖像就稱之為該細(xì)胞的核型(karyotype)，這通常是用顯微攝影得到的染色體相片剪貼而成（目前可通過相關(guān)軟件在電腦中自動排列）。在顯帶技術(shù)問世以前，人們主要根據(jù)染色體的大小、著絲粒的位置，將人類染色體順次由1編到22號，并分為七組。但要想精確、有把握地鑒別每條染色體是比較困難的。70年代初出現(xiàn)了染色體顯帶技術(shù)，不僅解決了染色體識別困難的問題，而且為深入研究染色體異常及基因定位創(chuàng)造了條件。將染色體標(biāo)本用顯帶方法處理后，再用Giemsa染色，這類技術(shù)就稱為G分帶

19、，通過顯微攝影，就可得到G帶染色體的顯微相片。 三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料：顯微相片1份2張。 實(shí)驗(yàn)器材：鑷子、剪刀、膠水、實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1先貼一張相片于報(bào)告紙上方。 2將另一相片上的染色體逐個剪下，按丹佛和人類染色體遺傳學(xué)命名的國際體制（ISCN）排列編號。粘貼時短臂向上，長臂向下。 3在分析結(jié)果中，寫出該細(xì)胞的核型式，注明性染色體。 五、作業(yè) 剪貼正常男性或女性染色體顯微相片一張。 附 人類染色體G分帶特征描述 1號染色體最突出的特征是在長臂近著絲粒處有一塊濃染的塊狀物質(zhì)。長臂有5條深帶，中央一條最寬最深。短臂近著絲粒端1/2處有2條寬闊的深帶，遠(yuǎn)端有34條較窄的淡帶。2號染色體與

20、1號染色體相比為亞中著絲粒并缺乏明顯的界標(biāo)。長臂有45條分布均勻的深帶，中央2個常融合為1個帶。3號染色體中央著絲粒染色體，帶型近乎對稱。兩臂的近端和遠(yuǎn)端染色甚深，而中心部位染色較淺。4號染色體與5染色體相比著色均勻。長臂上有45條很均勻的深帶，短臂中央有12條深帶。5號染色體長臂中部有一寬的中央帶，遠(yuǎn)端有2個深帶。短臂可見12條深帶，遠(yuǎn)端的深帶寬且色濃。6號染色體 長臂有4條均勻的帶，短臂中部有一明顯而寬闊的淺帶，其近、遠(yuǎn)端各有一深帶，近端深帶緊貼著絲粒。7號染色體 長臂有3條帶，遠(yuǎn)端一條較淺。短臂上有3條深帶，遠(yuǎn)端一條較寬且色深，有如“瓶蓋”。8號染色體長臂中部有一寬帶，短臂有2條分布均勻

21、的深帶，中部有一較明顯的淺帶。9號染色體長臂有2條均勻隔開的明顯深帶，短臂有特別的心形外貌，近端和中部各有一深帶。 10號染色體長臂有3條明顯的深帶，其中近端一條帶最深，短臂近端和近中部有一寬帶。 11號染色體 長臂緊貼著絲粒有一深帶，遠(yuǎn)端可見一明顯的較寬的深帶，這條深帶與近端的深帶之間的1條寬闊的淺帶。短臂近中部有一深帶。12號染色體 長臂緊貼著絲粒有一深帶，中部有一寬的深帶，這條深帶與近端深帶之間有一明顯淺帶。但與11號染色體比較，這條淺帶較窄，是區(qū)別11、12號染色體的主要特征。 13號染色體 長臂可見4條深帶。 14號染色體 長臂近端有一深帶，其遠(yuǎn)端也有一明顯的深帶。 15號染色體 長

22、臂近中部有一明顯的深帶，遠(yuǎn)端著色淺，有時可見2條淺帶。16號染色體 長臂中和遠(yuǎn)端各有一深帶，有時遠(yuǎn)端不明顯。短臂染色淺，可有12條帶。 17號染色體長臂遠(yuǎn)端有一深帶，這條帶與著絲粒之間為一明顯而寬的淺帶。短臂上的一條窄帶緊貼著絲粒。 18號染色體 長臂有2條寬帶，近端一條較遠(yuǎn)端的寬些，短臂上有一窄帶。19號染色體著絲粒及周圍為深帶，其余均為淺帶。 20號染色體 兩臂的遠(yuǎn)端著色，短臂著色較長臂深些。 21號染色體長臂近端有一寬闊深帶，遠(yuǎn)端淺染。 22號染色體長臂上有2條深帶，近端的一條著色深，緊貼著絲粒。近中部的一條著色淺，有時不顯現(xiàn)。X染色體 長臂可見45條深帶，近中央有一與短臂相似的深帶，似

23、“竹節(jié)”狀。短臂中部有明顯中央深帶。Y染色體長臂有2條遠(yuǎn)端帶，有時整個長臂被染成深帶。帶 型 識 別 口 訣一禿二蛇三蝶飄 四象鞭炮五黑腰 六號1、4小白臉七上八下九苗條 十號q 肩帶好 十一低來十二高十三、十四、十五號（3.2.1） 十六q縊痕大 十七q帶腳鐐十八人小大肚泡 十九是黑腰 二十頭重腳底淺二十一象個葫蘆瓢 二十二頭小，身子大 X扁擔(dān)，兩頭挑 人類染色體核型分析實(shí)驗(yàn)報(bào)告 班級 -姓名 - 標(biāo)本編號： 分析結(jié)果： 1 2 3 4 5 A B 6 7 8 9 10 11 12 C 13 14 15 16 17 18 19 20 D E F 21 22 G 性染色體實(shí)驗(yàn)三 人類染色體G帶

24、標(biāo)本制備及觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)掌握G帶標(biāo)本制備的基本方法，學(xué)會在顯微鏡下直接觀察G帶分裂相。 二、實(shí)驗(yàn)原理有許多顯示G帶的方法，最常用的是將已經(jīng)過老化的染色體制片放到37胰酶中進(jìn)行處理，然后用Giemsa染色。通過胰酶處理使G帶區(qū)的疏水蛋白被除去或使它們構(gòu)型變?yōu)楦杷疇顟B(tài)，由此可見在G帶區(qū)中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。Giemsa染料是由天青和伊紅組成的，染色首先取決于二個天青分子同DNA結(jié)合，在此基礎(chǔ)上結(jié)合一個伊紅分子，其次取決于一個有助于染料沉淀物積累的疏水環(huán)境。關(guān)于顯帶機(jī)理有多種論點(diǎn)，總的來說，還不能完全解釋顯帶的機(jī)理問題。 三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)材料 常規(guī)的人類體外周血染色體制片。 實(shí)驗(yàn)

25、器材恒溫水浴箱、燒杯、染缸、顯微鏡附油鏡頭、香柏油、擦鏡紙、恒溫培養(yǎng)箱、鑷子、記號筆或鉛筆等。 藥品和試劑 1Hanks液 NaCI 2.0 gKCI 0.1 g Na2HPO4.12H2O 0.0375 gK2HPO4 0.015 g葡萄糖 0.25 g加雙蒸水250 ml及1%酚紅0.5 ml，成Hanks液。 2胰酶液 稱取胰酶0.2 g溶于100 ml Hanks液中，攪拌半小時，用1N NaOH調(diào)pH7.07.2，冷凍保存。（最好現(xiàn)配現(xiàn)用） 3磷酸緩沖液 ( pH6.8 ) 4Giemsa染液 5生理鹽水 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1先將胰酶液水浴加熱到37。 2將染色體標(biāo)本浸入胰酶液中，作用時

26、間幾秒到幾十秒不等，依樣本存放時間長短而定。(標(biāo)本需預(yù)先經(jīng)6070烤2小時，或37恒溫老化57天。標(biāo)本太新鮮，染色體有些毛) 3取出玻片標(biāo)本，在生理鹽水中過一下，再經(jīng)過蒸餾水洗。 4Giemsa染液染色8分鐘。 5自來水洗、晾干。6鏡檢。選擇分散及顯帶良好的分裂相，在油鏡下觀察。如觀察到染色體變粗并顯得毛糙邊緣，有時甚至呈糊狀，是處理過度了。觀察細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)：（1） 細(xì)胞完整，輪廓清晰，染色體在同一平面上均勻分布。（2） 染色體形態(tài)和分散良好，最好無重疊現(xiàn)象，即使染色體個別重疊，也要能明顯辨別。（3） 所觀察的染色體長短大致一樣，處于同一有絲分裂時期。（4） 在所觀察的染色體周圍沒有多個或單個散

27、在的染色體。五、注意事項(xiàng)1帶效果的好壞，主要決定于染色體的標(biāo)本質(zhì)量。標(biāo)本染色體要長，染色體分散合適，背景無胞漿，標(biāo)本未老化即保存時間過長。2要注意胰酶處理的溫度和時間，穩(wěn)定顯帶的條件，才能保證顯帶效果。3磷酸緩沖液的pH值不要過堿，偏酸為宜，否則著色不鮮明。4G帶制備有許多種方法，各個實(shí)驗(yàn)室在細(xì)節(jié)處理上均不同，最好總結(jié)出適合自己實(shí)驗(yàn)室采用的方法。如果使用效果良好，不要輕易更換新方法。 六、作業(yè)畫出顯微鏡下你所觀察的分裂相，要求標(biāo)明染色體號數(shù)，請實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師復(fù)核。 實(shí)驗(yàn)四 Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥（DMD）基因檢測一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誅uchenne型肌營養(yǎng)不良癥基因（DMD）檢測的簡便方法。

28、二、實(shí)驗(yàn)原理1985年，Kary Mullis創(chuàng)建了聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，簡稱PCR技術(shù)。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時，對待檢原始材料質(zhì)量要求低等特點(diǎn)。PCR反應(yīng)是由變性（denaturation）、模板與引物結(jié)合（復(fù)性annealing）及延伸（extension）三個步驟為一個周期的不斷重復(fù)過程，經(jīng)過2530次循環(huán)之后，理論上可擴(kuò)增109倍。PCR反應(yīng)中通常只有一對寡核苷酸引物，而多重PCR（multiplex PCR）則是用幾對引物在同一個PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以同時擴(kuò)增出幾個不同專一靶區(qū)域的片段。D

29、uchenne型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一原發(fā)于肌肉組織的遺傳病，特點(diǎn)是進(jìn)行性加重的肌肉萎縮和無力，臨床表現(xiàn)腿的假性肥大，血清酶學(xué)明顯升高。本病呈X連鎖隱性遺傳，一般男性兒童發(fā)病。DMD基因定位于Xq21.2-21.3之間，全長2 300kb左右，由79個外顯子組成，編碼含3 685個氨基酸的蛋白質(zhì)抗肌營養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)，這種蛋白具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)的功能。DMD基因有多種突變形式，60%是外顯子缺失突變，5%是重復(fù)突變，35%可能是很小的DNA片段缺失或點(diǎn)突變。通常選擇DMD基因中9個缺失熱點(diǎn)的外顯子擴(kuò)增，可檢

30、出缺失突變中的90%。為節(jié)省經(jīng)費(fèi)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為擴(kuò)增DMD基因中4個外顯子，其中外顯子45 和48在中國患者中的檢出率分別為26%和48%。DMD基因4個外顯子的引物順序外顯子 PCR產(chǎn)物大小 引物F 引物R8 360 gtcctttacacactttacctgttgag ggcctcattctcatgttctaattag19 459 ttctaccacatcccattttcttcca gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc45 547 aaacatggaacatccttgtggggac cattcctattagatctgtcgccctac 48 506 ttgaatacattgg

31、ttaaatcccaacatg cctgaataaagtcttccttaccacac三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)材料正常對照DNA樣本、DMD患者DNA樣本?；蚪MDNA 稀釋至100ng/ml，備用。 實(shí)驗(yàn)器材微量加樣器、槍頭（10ml，100ml）、Eppendorf管、PCR 儀、臺式高速離心機(jī)、電泳儀、水平電泳槽、紫外透射反射儀。藥品和試劑PCR試劑盒、dNTPs、Primer R + F混合液:包括外顯子8、19、45和48，終濃度各25pmol/ml、石蠟油、瓊脂糖、6×載樣緩沖液、溴化乙錠、pUC19/Msp、1 ×TBE 電泳緩沖液。 四、實(shí)驗(yàn)步驟1正常對照DNA樣本

32、、DMD患者DNA樣本分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR操作如下：每一個薄壁離心管中加入：（反應(yīng)總體積為25ml） 雙蒸水 17.5 ml 10×Buffer 2.5 ml MgCl2 2 ml dNTPs 0.5 ml Primer R+F (混合) 2 ml DNA 模板 0.5 ml Taq-DNA聚合酶 0.3 ml 石蠟油 1滴 放置在PCR循環(huán)儀上，循環(huán)參數(shù)設(shè)置為： Step 1 (1個循環(huán)) 94°C 5分鐘 Step 2 (30個循環(huán)) 94°C 30秒 56°C 30秒 72°C 30秒 Step 3 (1個循環(huán)) 72°C

33、 7分鐘2PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（1）配制2% 的瓊脂糖凝膠配制1×TBE電泳緩沖液70 ml于三角燒瓶中，稱取1.4 g的瓊脂糖粉放入后，沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化,冷卻至60°C，加入溴化乙錠至終濃度為0.5 mg/ml，混勻凝膠，倒入電泳槽中，插入梳子，待凝固。（2）向電泳槽中倒入1×TBE，其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子。（3）取PCR擴(kuò)增樣品10ml加入3ml的6×載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi)。（4）接通電源，一般紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(靠近加樣孔的一端為負(fù)極)。電壓為15 V/cm(長

34、度以兩個電極之間的距離計(jì)算)。140 V，電泳2小時左右。根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳。（5）卸下凝膠，紫外儀上觀察電泳條帶，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker pUC19/Msp比較，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及片段大小。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以觀察到正常對照樣本有4條帶，從負(fù)極往正極分別為外顯子45、48、19和8。DMD患者缺失不同的外顯子，如有缺失需3次以上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)來證實(shí) 泳道1、2、5、7和8是正常對照；泳道3、4和9是第19外顯子缺失的患者；泳道6是外顯子48缺失的患者；泳道10和11是外顯子45缺失的患者。M：pUC19/Msp。六、注意事項(xiàng)1引物設(shè)計(jì)時長度 15 30個堿基為宜，G +

35、 C含量一般為40% 60%。2退火溫度決定PCR反應(yīng)的特異性，退火溫度高，PCR反應(yīng)的特異性好；溫度低，有時會有非特異性條帶。3Mg2+ 濃度對擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性及產(chǎn)量有顯著影響，Mg2+ 濃度低，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性好，但有時產(chǎn)量低；Mg2+濃度高，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性差，有非特異性條帶。4PCR循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上25 30次循環(huán)后PCR產(chǎn)物積累即可達(dá)到最大值。在滿足產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。 實(shí)驗(yàn)五 遺傳病基因突變分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過實(shí)驗(yàn)掌握DNA的提取、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以及DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）等幾種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，并了解SSCP分

36、析法是檢測基因突變的一種基本方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1DNA抽提核基因DNA可以從任何有核細(xì)胞中提出，人外周靜脈血的淋巴細(xì)胞是抽提核基因DNA最方便的材料。EDTA抗凝的外周靜脈血經(jīng)離心處理后，可分離得到大量淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核。由于DNA在細(xì)胞核內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的，因此提取過程中必須將其中的蛋白質(zhì)除去，蛋白酶K可用于消化細(xì)胞核膜及核內(nèi)蛋白質(zhì)，消化的蛋白質(zhì)用飽和NaCl沉淀，核DNA最后用酒精析出。2聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外由引物介導(dǎo)的特定DNA序列的酶擴(kuò)增方法，由于此方法對樣本要求的微量性以及它特異、敏感、高速的特

37、性，近年來得到廣泛應(yīng)用。全過程是基于一套“三步曲”的若干輪次的循環(huán)組合而成的。依次為DNA模板熱變性，雙鏈DNA解鏈成單鏈；在低溫下與引物退火，引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對；在適宜溫度下Taq DNA聚合酶催化引物延伸。以上三步為一個循環(huán)，循環(huán)2535次，模板DNA可擴(kuò)增100萬倍左右，整個反應(yīng)在23小時內(nèi)完成（見圖）。3單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析法是一種DNA單鏈凝膠電泳技術(shù),該法具有快速、簡便、靈敏和適用于大樣本篩查的特點(diǎn)，可有效檢出堿基置換、缺失、插入等基因變異。目前，已廣泛用于癌基因、遺傳

38、病基因診斷等領(lǐng)域。SSCP原理是在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中，單鏈DNA遷移率除與DNA長度有關(guān)外，更主要取決于DNA單鏈所形成的空間構(gòu)象，相同長度的單鏈DNA因其順序不同或單個堿基差異，所形成的構(gòu)象就會不同。PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后進(jìn)行單鏈DNA凝膠電泳時，每條單鏈處于一定的位置，靶DNA中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個堿基置換時, 就會出現(xiàn)泳動變位，從而提示該片段有基因突變存在（見圖）。對于小于300bp單鏈DNA片段，SSCP分析的檢測靈敏度可達(dá)90%99%。隨著DNA長度增加，其檢測靈敏度相對減弱。 三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料人外周靜脈血實(shí)驗(yàn)器材吸管、Eppendorf管、薄壁離心管、PCR儀、

39、高速臺式離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、紫外透射反射儀、注射器（2ml）、針頭、10ml玻璃離心管、10ml塑料離心管、各種微量加樣器、槍頭（10 ml、100 ml、1000 ml）、天平、各種試管架、燒杯、石蠟?zāi)ぁ⒘客?、恒溫水浴箱、記號筆、不銹鋼燒鍋、高壓滅菌鍋、搪瓷盤、玻璃紙、電磁爐等。藥品和試劑 1用于DNA提取藥品和試劑10mg/ml蛋白酶K (-20冰箱保存) 0.5 M EDTA（pH8.0，滅菌保存） TE緩沖液（pH8.0，滅菌保存） 緩沖液 A（buffer A）： 蔗糖 109.536 g 2M Tris.HCI 5 ml Triton-X-100 10 ml 2M MgCI2

40、2.5 ml 雙蒸水加至1000ml，過濾，4冰箱保存。 2M Tris.HCI（pH8.0） （滅菌保存） 2M MgCI2（滅菌保存）5M NaCl（滅菌保存）10% SDS瓊脂糖（進(jìn)口分裝）5×TBE 核溶解緩沖液 5M NaCl 40 ml (nuclei lysis buffer) 0.5M EDTA （pH8.0） 2 ml 2M Tris.HCl （pH8.0） 2.5 ml 雙蒸水 455.5 ml 高壓滅菌保存 蛋白酶K工作液 1份樣本為 2 ml血 10 samples 20 samples 10mg/ml蛋白酶K 100 ml 200 ml 10% SDS 10

41、0 ml 200 ml 0.4M EDTA 5 ml 10 ml dd H2O 794 ml 1590 ml total volume 1000 ml 2000 ml1 mg/ ml EB（溴乙錠）6×加樣緩沖液2用于PCR反應(yīng)10×Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq-DNA聚合酶由所購試劑公司統(tǒng)一提供。DNA 模板：正常對照來自實(shí)驗(yàn)者的血液樣本，基因突變樣本來自1例角膜營養(yǎng)不良癥患者。擴(kuò)增片段為角膜營養(yǎng)不良癥基因BIGH3第11外顯子，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為223bp。 引物序列如下： Primer F：CTCGTGGGAGTATAACCAGT Primer R：TGGGCAGAAGCTCCACCCGG 3用于SSCP 雙甲基丙烯酰胺（Bis） 丙烯酰胺 （Acr） TEMED 30%貯存液： Acr 29 g Bis 1 g 溶于100ml滅菌雙蒸水中 10% APS（過硫酸胺）