散發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者BRCA1、BRCA2基因的表達及臨床意義

1、散發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者BRCA1、BRCA2基因的表達及臨床意義Curiosity killed the cat.【摘要】目的：研究散發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者乳腺癌易感基因1(breastcancersusceptibilitygene1,BRCA1)、乳腺癌易感基因2的表達及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。方法:采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)法對95例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、28例乳腺腺病患者的BRCA1、BRCA2基因進行檢測,并從病理科資料中提取患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及雌激素受體(estrogenreceptor,ER)、人表皮生長因子受體2(humanepidermalgro

2、wthfactorreceptor2,HER2)的表達結(jié)果,分析BRCA1、BRCA2基因水平和患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及ER、HER2表達的關(guān)系。結(jié)果:BRCA1、BRCA2基因在癌組織的陽性率分別為50.5%(48/95)、52.6%(50/95),癌旁組織陽性率66.3%(63/95)、72.6%(69/95),乳腺腺病組織陽性率89.3%(25/28)、92.9%(26/28)。癌組織與癌旁組織、乳腺腺病組織比較,BRCA1、BRCA2基因的陽性率均下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)()。BRCA1、BRCA2的陽性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.228,-0.223

3、,P0.05),與ER的表達均呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.37,-0.289,P0.05),與HER2的表達均呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.282,-0.498,P0.05)。結(jié)論:乳腺上皮中BRCA1和BRCA2基因?qū)θ橄侔┑陌l(fā)生、發(fā)展具有一定的作用,檢測此兩種基因的表達可協(xié)助篩查出乳腺癌高?；颊呒霸缙诎l(fā)現(xiàn)乳腺癌。BRCA1和BRCA2基因亦可作為評價乳腺癌生物學(xué)特性和預(yù)后的潛在指標(biāo)?！娟P(guān)鍵詞】乳腺癌易感基因;雌激素受體;乳腺浸潤性導(dǎo)管癌;乳腺腺病The small courtesies sweeten life; the greater ennoble it. AbstractObjective

4、:Toinvestigatethelevelofbreastcancersusceptibilitygene1(BRCA1)andBRCA2insporadicinvasiveductalcarcinomaandtoanalyzeitsrelationshipwithotherclinicopathologicparameters.Methods:RTPCRwasusedtodetectthelevelofgeneBRCA1andBRCA2in95casesofsporadicinvasiveductalcarcinomatissuesamplesand28adenosistissuesamp

5、les.Theclinicopathologicparametersincludingtumorsize,axillarynodalstatus,estrogenreceptorandHER2expressionwereobtainedfrompathologicaldocuments.ThelevelofBRCA1/BRCA2wascomparedbetweenthesporadicinvasiveductalcarcinomatissuesandadenosistissues.Insporadicinvasiveductalcarcinoma,thecorrelationbetweenBR

6、CA1/BRCA2andotherclinicopathologicparametersmentionedabovewasfurtheranalyzed.Results:ThepositiveratesofBRCA1genewere50.5%(48/95)inbreastcancertissuesand89.3%(25/28)inadenosistissues,whileinbreastcanceradjacenttissues,therateswere66.3%(63/95).ThepositiveratesofBRCA2genewere52.6%(50/95)inbreastcancert

7、issuesand92.9%(26/28)inadenosistissues,whileinbreastcanceradjacenttissues,therateswere72.6%(69/95).ThepositiveratesofBRCA1andBRCA2werelowerinbreastcancertissuesthanincanceradjacenttissuesandadenosistissues,withasignificantdifference(P0.05).ThegeneBRCA1/BRCA2wasnegativelycorrelatedwithlymphnodemetast

8、asis,andnegativelycorrelatedwiththeexpressionofestrogenreceptorandHER2expression(P0.05).Conclusion:ThegeneBRCA1/BRCA2inbreastepitheliummayplayanimportantroleinthedevelopmentofbreastcarcinoma.Todetectthemhelpstochoosepatientsathighriskofdevelopingbreastcarcinomaandachieveearlydiagnosis.ThegeneBRCA1/B

9、RCA2maybeapotentialmarkerforestimatingthebiologicalbehaviorandprognosisofbreastcancer.Keywordsbreastcancersusceptibilitygene;estrogenreceptor;invasiveductalcarcinoma;adenosisRiches do not always bring happiness. 乳腺癌是指發(fā)生于乳腺導(dǎo)管或乳腺小葉上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,占女性全部惡性腫瘤的22%,在歐美發(fā)達國家甚至高達26%1,其中浸潤性導(dǎo)管癌(invasiveductalcarcinom

10、a,IDC)是臨床最常見的病理類型。乳腺癌易感基因1(breastcancersusceptibilitygene1,BRCA1)和乳腺癌易感基因2(BRCA2)是迄今發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌發(fā)生有關(guān)的易感基因。乳腺癌以遺傳性和散發(fā)性兩種形式存在,遺傳性乳腺癌約占5%10%,這些遺傳性乳腺癌中的21%40%與BRCA1、BRCA2基因突變有關(guān)2。但BRCA1和BRCA2與非遺傳性、散發(fā)性乳腺癌相關(guān)性的報道較少3(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。我們檢測了散發(fā)性浸潤性導(dǎo)管癌、癌旁組織及腺病組織中BRCA1、BRCA2基因的陽性率,比較BRCA1、BRCA2基因在三者之間的差異,并對散發(fā)性浸潤性導(dǎo)管癌中BRCA1

11、、BRCA2基因與臨床相關(guān)病理特征之間的關(guān)系進行了分析。1材料與方法1.1材料Wine and judgement mature with age. 1.1.1臨床資料及標(biāo)本收集江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院2008年5月到2009年5月經(jīng)病理證實的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者手術(shù)切除標(biāo)本95例及乳腺腺病患者手術(shù)切除標(biāo)本28例,所有乳腺癌病例無一級或二級親屬患乳腺癌,患者年齡4275歲,平均54歲;乳腺腺病患者年齡3564歲,平均49歲。所有標(biāo)本術(shù)后0.51h迅速-70凍存?zhèn)溆谩?.1.2主要試劑與儀器Trizol(Invitrogen公司),RTPCR試劑盒(Fermentas公司),PCR儀(7300型,美

12、國ABI公司),凝膠成像儀(英國Gene公司)。Joy put heart into a man. 1.2方法1.2.1RNA的提取采用Trizol一步法快速提取組織總RNA,通過紫外分光光度法測定D(260nm)與D(280)nm,計算RNA的濃度和純度;取D(260nm)/D(280nm)1.8至2.0之間的樣本。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。1.2.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系為50l。RNA2l,DEPC水8l,隨機六聚寡核苷酸引物(0.05g/l)4l,共14l,655min,取出后冰上放置5min,再加入下列體系:DEPC水20.5l,5RT緩沖液10l,dNTPs2.5l,逆轉(zhuǎn)錄酶M

13、MLV2.0l,RNasin1.0l,反應(yīng)條件為4260min,-20保存。1.2.3聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)體系為25l,包括10緩沖液2.5l,MgCl22.0l,dNTP0.5l,Taq酶(1U/l)1l,H2O16l,cDNA1l,引物11l,引物21l。BRCA1上游引物:5GATTTGACGGAAACATCTTAC3,下游引物:5CCAGCATCAGTAGTATGA3;反應(yīng)條件為945min,9530s,5730s,7230s，30個循環(huán)后72延伸10min。BRCA2上游引物:5GTTGTGAAAAAAACAGGACTTG3,下游引物:5CAGTCTTTAGTTGGGGTGGA

14、3。反應(yīng)條件為945min，9530s，56.930s，7230s,30個循環(huán)后72延伸10min。肌動蛋白上游引物:5CTCGCGCTACTCTCTCTTTC3,下游引物:5CATGTCTCGATCCCACTTAAC3。以看家基因肌動蛋白為內(nèi)參照進行質(zhì)控和標(biāo)化。每個PCR反應(yīng)均重復(fù)3次。擴增產(chǎn)物在含0.5mg/L溴乙啶的2.0%瓊脂糖凝膠中電泳分離,于凝膠成像儀上掃描分析條帶。BRCA1/2表達水平的相對值=BRCA1/2D值/肌動蛋白D值。Throw away the apple because of the core. 2結(jié)果2.1BRCA1基因在乳腺癌、癌旁及乳腺腺病組織中的檢出情況H

15、ide ones talents in a napkin. 經(jīng)RTPCR分析發(fā)現(xiàn),乳腺癌組織中BRCA1mRNA的相對水平為0.41530.1556,而在乳腺癌旁及乳腺腺病組織中其表達水平分別為1.11270.2333和1.00740.1931,后兩者明顯高于前者(圖1)。Take a pain for a pleasure all wise men can. BRCA1基因在乳腺癌、癌旁組織及乳腺腺病組織中的陽性表達率分別為50.5%(48/95)、66.3%(63/95)、89.3%(25/28)。經(jīng)2檢驗分析得出,在乳腺癌、癌旁組織及乳腺腺病組織中BRCA1陽性率呈遞增趨勢,具有相關(guān)性(

16、2=14.953,P=0.0010.005)。與乳腺腺病比較,BRCA1在乳腺癌及癌旁組織中的陽性率皆明顯下降(2=13.466,P0.001,2=5.605,P=0.0180.05)。BRCA1在乳腺癌和癌旁組織中的陽性率間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(2=4.875,P=0.0270.05)。2.2BRCA2基因在乳腺癌、癌旁及腺病組織中的檢出情況經(jīng)RTPCR分析發(fā)現(xiàn),乳腺癌組織中BRCA2mRNA的相對水平為0.29660.2334,而在乳腺癌旁及乳腺腺病組織中其表達水平分別為0.75970.1228和0.66510.2214,后兩者明顯高于前者。見圖2。BRCA2基因在乳腺癌、癌旁組織及乳腺腺病

17、組織中的陽性表達率分別為52.6%(50/95)、72.6%(69/95)、92.9%(26/28)。經(jīng)2檢驗分析得出,在乳腺癌、癌旁組織及乳腺腺病組織中BRCA2陽性表達呈遞增趨勢,具有相關(guān)性(2=18.540,P0.001)。與乳腺腺病相比,BRCA2在乳腺癌及癌旁組織中的陽性率皆明顯下降,具有相關(guān)性(2=14.821,P0.001,2=5.032,P=0.0250.05)。BRCA2在乳腺癌和癌旁組織中的陽性率差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(2=8.118,P=0.0040.05)。論文教育信息網(wǎng) 2.3BRCA1基因與IDC臨床病理的關(guān)系經(jīng)多個樣本的2檢驗，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移13個淋巴結(jié),410個

18、淋巴結(jié)組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0260.05),經(jīng)Spearman相關(guān)分析提示BRCA1基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(r=-0.228,P=0.0260.05),BRCA1基因在雌激素受體(estrogenreceptor,ER),人表皮生長因子受體2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2,HER2)陰性組的檢出率均高于ER,HER2陽性組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P1=0.0390.05,P2=0.0060.05),經(jīng)Spearman相關(guān)分析提示BRCA1基因的檢出與ER呈負(fù)相關(guān)(r=-0.37,P0.001),與HER2呈負(fù)相關(guān)(r=-0.282,P=0.

19、0060.05,表1)。2.4BRCA2基因與IDC臨床病理的關(guān)系經(jīng)多個樣本的2檢驗,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移13個淋巴結(jié),410個淋巴結(jié)組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0210.05)。經(jīng)Spearman相關(guān)分析提示BRCA2基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(r=-0.223,P=0.0300.05);BRCA2基因在ER,HER2陰性組的檢出率均高于ER,HER2陽性組,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P1=0.0050.05,P20.001),經(jīng)Spearman相關(guān)分析提示BRCA2基因的檢出與ER呈負(fù)相關(guān)(r=-0.289,P=0.0040.05),與HER2呈負(fù)相關(guān)(r=-0.498,P0.05)。見表1。

20、Self-confidence is the first requisite to human greatness. 3討論BRCA1基因是一種人乳腺癌易感基因,于1990年被Hall等發(fā)現(xiàn),具體定位于染色體17q21D17s1321D17s1325之間,是由22個編碼外顯子和2個非編碼外顯子構(gòu)成,全長約100kb4。該基因作為一種抑癌基因,在抑制細(xì)胞生長、細(xì)胞周期調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)及凋亡等重要細(xì)胞活動以及維持基因穩(wěn)定性中起重要作用5。BRCA1基因突變可導(dǎo)致這些功能的抑制或削弱。野生型BRCA1誘導(dǎo)凋亡并抑制雌激素依賴型轉(zhuǎn)錄通路,該通路與乳腺上皮細(xì)胞增生有關(guān),基因突變后抑制作

21、用減弱而致癌6。Yang等7觀察了175例日本散發(fā)性乳腺癌患者,其中有60例(34.3%)BRCA1表1BRCA1、BRCA2基因與臨床病理特征之間的關(guān)系HER2陽性582434陰性3726110.00619393160.001表達顯著減少和缺失,經(jīng)4.4年的隨訪,發(fā)現(xiàn)BRCA1陰性患者較陽性患者無瘤生存率明顯降低(分別為7%和35%)。本組結(jié)果顯示,BRCA1基因在乳腺腺病組織、癌旁組織及乳腺癌組織中的檢出率明顯降低。BRCA1主要通過E2F轉(zhuǎn)錄因子的作用以及CDKs復(fù)合物的磷酸化作用而參與細(xì)胞周期調(diào)控,抑制細(xì)胞進入增殖周期,阻止分裂,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。BRCA1表達減少,對細(xì)胞分裂的抑制作用減

22、弱,細(xì)胞在多種因素的作用下可最終發(fā)生癌變。Marcus等8發(fā)現(xiàn),與正常上皮細(xì)胞相比較,散發(fā)性乳腺癌癌細(xì)胞中BRCA1表達減少,而且BRCA1的減少與組織的潛在高惡性,包括低分化和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著聯(lián)系。我們的研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌中最常見的病理類型浸潤性導(dǎo)管癌中,隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的增多,BRCA1基因的檢出率減少,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。但BRCA1基因的檢出與腫瘤大小無關(guān)。BRCA1基因的陽性率在ER陰性、HER2陰性的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌明顯高于陽性組,表現(xiàn)為BRCA1基因與ER、HER2陰性表達相關(guān)聯(lián)。乳腺癌是一種激素依賴性腫瘤,ER、HER2表達情況已成為乳腺癌的重要預(yù)后因子,針對ER的內(nèi)分

23、泌治療及針對HER2的分子靶向治療已成為提高乳腺癌術(shù)后遠期生存率的重要手段,研究者們亦發(fā)現(xiàn)野生型BRCA1可以顯著抑制孕激素受體的活性9。另有報道發(fā)現(xiàn)10,BRCA1與ER不但相互影響,還可共同協(xié)同作用調(diào)節(jié)下游基因(如VEGF)。而HER2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白,也對細(xì)胞的增殖和分化起調(diào)節(jié)作用11,HER2通過抑制凋亡,上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子和血管通透性因子,促進腫瘤新生血管形成,增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力12。但BRCA1與HER2之間可能的調(diào)節(jié)機制尚不清楚。本實驗結(jié)果初步顯示,BRCA1基因可通過某種途徑影響ER和HER2的表達,但具體機制仍需進一步探討。BRCA2基因是繼BRCA1后發(fā)現(xiàn)

24、的第二個乳腺癌易感基因,基因序列與BRCA1無明顯關(guān)聯(lián)13,定位于13q12-13,可轉(zhuǎn)錄7.3kbmRNA,編碼3418個氨基酸殘基的長肽鏈,較易發(fā)生基因突變,導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)生物特性的丟失14,其突變可增加早期乳腺癌的發(fā)病率。目前BRCA2基因的確切作用機制還不十分清楚15,但有報道16其通過Rad51能與斷裂的DNA相結(jié)合,通過同源同組的過程進行雙鏈修復(fù),此過程亦可能與p53基因的突變有著較大關(guān)系17。如果BRCA2修復(fù)功能喪失,則有可能會引起染色體的變化,進而可誘發(fā)癌癥的發(fā)生。本組結(jié)果顯示,BRCA2基因在乳腺腺病組織、癌旁組織及乳腺癌組織中的檢出率明顯降低,具有相關(guān)性。本實驗結(jié)果也

25、從側(cè)面證明了BRCA2基因在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著一定的作用。盡管BRCA2基因的作用機制未明確,但通過對其的檢測仍可以早期發(fā)現(xiàn)一些腫瘤,如宮頸癌、胃癌、前列腺癌等18,為這些腫瘤的治療爭取時間。本實驗同時還提示,BRCA2基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目呈負(fù)相關(guān),推斷該基因在對乳腺癌的預(yù)后上起著一定的判斷作用,但該基因與腫瘤大小無明顯關(guān)聯(lián)。BRCA2基因在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,也可能與癌基因HER2有協(xié)同作用19。但本實驗中發(fā)現(xiàn)BRCA2基因的檢出與HER2呈負(fù)相關(guān),可能與HER2陽性表達者惡性程度較高,侵襲能力強有關(guān)。實驗結(jié)果也提示BRCA2基因的檢出與ER呈負(fù)相關(guān),但具體影響機制尚不

26、清楚。盡管BRCA2抑癌作用的具體機制及途徑尚未明了,對有關(guān)BRCA2基因及其在臨床上應(yīng)用的認(rèn)識不多,但其對乳腺癌乃至其他腫瘤發(fā)生的意義,必將受到廣泛重視。He that runs fastest gets the ring. BRCA1和BRCA2都是乳腺癌易感基因,在腫瘤發(fā)生中的作用及其調(diào)節(jié)機制還不十分清楚。但早期測定BRCA1與BRCA2基因可協(xié)助篩查高危乳腺癌患者,并可望為散發(fā)性乳腺癌的早期診斷、預(yù)后判斷及治療方案選擇提供重要的依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】1ParkinDM,BrayF,FerlayJ,etal.Estimatingtheworldcancerburden:Globocan200

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