血清蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測診斷早期胃癌臨床意義(1)

1、血清蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測診斷早期胃癌臨床意義(1)作者：趙長宏,陸海波,馬玉彥 ,魯海玲,唐雅莉,李鑫 【摘要】 目的 應(yīng)用SELDI蛋白質(zhì)芯片檢測胃癌患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，篩選候選腫瘤標(biāo)志物以建立診斷模型，并探討其診斷早期胃癌的臨床意義。方法 表面加強(qiáng)激光解吸電離?飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI?TOF?MS）技術(shù)及其配套蛋白質(zhì)芯片檢測34例胃癌患者（/期12例與/期22例）和30例健康人的血清蛋白質(zhì)組圖譜，運(yùn)用判別分析處理數(shù)據(jù)篩選標(biāo)志物并建立診斷模型。結(jié)果 2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z和1 588m/z等5個(gè)蛋白質(zhì)峰組合所構(gòu)建的診斷模型能達(dá)到鑒別胃癌患者

2、和健康人的最佳診斷效果，特異度94.1%（32/34）， 靈敏度93.3%（28/30）。單個(gè)4 665m/z蛋白質(zhì)峰診斷模型可達(dá)到鑒別/期與/期胃癌效果，其特異度91.6%（11/12），靈敏度95.4%（21/22)。結(jié)論 該方法在胃癌的診斷尤其是早期診斷、術(shù)前分期及候選腫瘤標(biāo)志物篩選等方面具有一定價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。 【關(guān)鍵詞】 早期胃癌SELDI?TOF診斷；蛋白質(zhì)組學(xué)Detection and Evaluation of Serum Proteomic Patterns by SELDI?TOF?MS in Early Gastric CancerCorresponding Aut

3、hor:LU Hai?bo,E?mail:lu_haibo200Abstract：Objective To detect the serum proteomic patterns using SELDI?TOF?MS ProteinChip array technology in gastric cancer,screen biomarker candidates,build diagnostic models and evaluate its clinical significance in early gastric cancer.Methods SELDI?TOF?MS ProteinC

4、hip was used to detect the serum proteomic patterns of 34 patients with gastric cancer （12 cases of /stage and 22 cases of / stage） and 30 healthy people.The diagnostic models were developed and validated by discriminant analysis.Results The model composed by 5 protein peaks 2 046m/z、3 179m/z、1 817m

5、/z、1 725m/z and 1 588m/z could do the best in the diagnosis of gastric cancer.The specificity and sensitivity of it were 94.1%（32/34）and 93.3%（28/30） respectively.The single peak 4 665m/z can distinguish stage/stage and / gastric cancer,the specificity and sensitivity of it were 91.7%，(11/12) and 95

6、.4%，(21/22).Conclusion This method show great potential for the early detection,staging before operation and screening novel and better biomarkers to early gastric cancer.Key words：Early Gastric cancer; SELDI?TOF; Diagnosis; Proteomics胃癌是常見惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)為第二多發(fā)惡性腫瘤，是消化系統(tǒng)最多發(fā)腫瘤1，2。可能是胃癌臨床的異質(zhì)性表現(xiàn)，迄今為止胃癌尚缺乏

7、理想的腫瘤標(biāo)志物，從而也給其早期診斷、術(shù)后療效評價(jià)、預(yù)后監(jiān)測及胃癌患者的康復(fù)等造成了一定的困難。表面加強(qiáng)激光解吸電離?飛行時(shí)間質(zhì)譜（Surface?enhanced laser desorption/ionization time?of?flight mass spectrometry,SELDI?TOF?MS）是近年來發(fā)展起來的一種全新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，其基本原理是通過特定的化學(xué)表面結(jié)合蛋白質(zhì)分子再以激光轟擊，使蛋白質(zhì)成為離子而飛行于電場中并被檢測器所測得，進(jìn)而用不同位置、強(qiáng)度的峰來表示各種不同的蛋白質(zhì)及其相對含量，最終形成可用于分析的圖譜。該方法克服了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法所存在的諸多

8、問題，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)譜技術(shù)用于臨床檢測的飛躍3，4。本研究應(yīng)用SELDI質(zhì)譜儀及其配套蛋白質(zhì)芯片檢測了34例胃癌患者和30例健康人的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，以篩選可用于臨床胃癌早期診斷的特異性生物標(biāo)記物。1資料和方法1.1資料 2004年1月8月間我院收治的初診胃癌患者34例，中位年齡52歲（3474歲）。常規(guī)根治手術(shù)后按UICC 1997年胃癌 PTNM分期法進(jìn)行分期，其中期患者6例，期6例，期5例， 17例，診斷均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。健康人群來自我院經(jīng)胃鏡取材并經(jīng)病理證實(shí)的無胃部疾病的30例，中位年齡49歲（2572歲）。所有血樣均于清晨空腹采集，靜置離心分離血清，80低溫冰箱保存。1.2主要儀器、軟件

9、及試劑 PBS?表面加強(qiáng)激光解吸電離?飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（SELDI?TOF?MS）、能量吸收分子SPA、CM10型蛋白質(zhì)芯片及相應(yīng)分析軟件ProteinChip Software 3.2.1（美國Ciphergen公司）；HEPES緩沖鹽（Sigma公司）；CHAPS緩沖鹽（Sigma公司）。1.3方法 CM?10 芯片（弱陽離子 疏水膜）1.3.1步驟 用HPLCH2O洗滌芯片，400r/min，震蕩5min三次。先將10mM/L HCL倒入帶蓋試管中蓋好后。震蕩5min。在用去離子水沖洗數(shù)次，再將芯片裝入HPLCH2O試管中震蕩5min。將芯片架子，膠墊超聲清洗干凈，用去離子水沖洗數(shù)次晾干后

10、，將芯片裝入處理器上。每孔加入200l 0.1M NaAC 結(jié)合buffer,室溫振蕩250r/min,5min重復(fù)一次。甩干后再上樣品。1.3.2樣品處理 血清樣品冰上溶解，4度離心10 000r/min，5min。取上清20l加入30l U9(含DTT)混勻，4度震蕩250/min,20min,每孔用封口膜封好。U1配法：100l U9(含DTT) 900l 50 mMHepes pH 7.0。每孔加入100l U1緩沖液混勻，蓋嚴(yán)振蕩250r/min，30min。從上述150l 變形樣品中取出50l,加入到200l 0.1M NaAC 結(jié)合buffer 中混勻，取出100l 上樣，室溫振

11、蕩250r/min,60min,取出樣品。每孔加入150l 0.1M NaAC buffer,室溫振蕩250r/min,5min,倒掉后加入150l NaACbuffer,共3次。再用1mM Hepes pH 4.0 淋洗芯片30s,重復(fù)一次。除去芯片晾干。將SPA高速離心30s,在SPA管中，加入200l乙腈，200l 1% TFA充分振蕩5min，靜止5min。離心1 000r/min 1min。每孔加入SPA 0.51.0l/點(diǎn)，重復(fù)一次。兩次之間各點(diǎn)風(fēng)干。1.3.3芯片檢測 用加有All?in?one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正質(zhì)譜儀，在Ciphergen ProteinChip軟件中

12、設(shè)定讀片程序讀取芯片數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)以每秒1109Hz的速度獲得原始數(shù)據(jù)并快速精確地繪制出蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。其中縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對含量，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比。1.3.4蛋白質(zhì)質(zhì)荷比 結(jié)合SPA后的蛋白質(zhì)在SELDI?TOF?MS氦氖激光器的激光轟擊下電離，帶有電荷的蛋白質(zhì)在加速電場的作用下，不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)在長度一定的真空管中飛行所需的時(shí)間不同，蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比（M/Z）與電離飛行時(shí)間的平方成正比。由E=UZ=1/2mv2；t=L/v推出M/Z=Kt2=(2U/L2)t2。其中Z為離子所帶電荷數(shù)，U為電壓，v為飛行速度，L為加速飛行電場電壓，K為常數(shù)。 1.3.5蛋白質(zhì)相對含量 帶有正電荷的蛋白質(zhì)離子

13、束在到達(dá)檢測器的一瞬間，電子倍增器將產(chǎn)生的瞬時(shí)電流（瞬時(shí)電流It=Q/t，其中Q為t時(shí)刻檢測器檢測到的電荷數(shù)）轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)的相對含量。1.4數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)定：激光強(qiáng)度190，靈敏度9，數(shù)據(jù)收集范圍1 50020 000m/z（蛋白質(zhì)質(zhì)量和電荷比值，以下簡稱質(zhì)荷比）。原始數(shù)據(jù)先以Proteinchip Software 3.2.1軟件校正，使總離子強(qiáng)度及分子量達(dá)到均一，并過濾噪音，初始噪音過濾值5，二次噪音過濾值2，以8%為最小閾值進(jìn)行聚類。經(jīng)上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，比較胃癌患者與健康人血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（由Proteinchip Software 3.2.1自帶的Biomarke

14、r Wizard 5.0軟件完成），用數(shù)據(jù)樹方法對目標(biāo)對象進(jìn)行分類，對數(shù)據(jù)分組及相關(guān)性性進(jìn)行分析。尋找兩組之間表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)峰，結(jié)合各個(gè)峰的權(quán)重比較不同蛋白質(zhì)峰排列組合的判別分析結(jié)果，選出最佳排列組合，最后同時(shí)輸出原始判別和交叉驗(yàn)證的結(jié)果。2結(jié)果2.1生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn) 用Biomarker Wizard軟件和Proteinchip Software軟件分析34例胃癌患者和30例健康人血清中蛋白質(zhì)的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z和1 588m/z等5個(gè)蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)記物可將正常人與胃癌患者準(zhǔn)確的分組。用這個(gè)生物標(biāo)記物分析數(shù)據(jù)共產(chǎn)生7個(gè)

15、終節(jié)點(diǎn)，見圖1：其中1、2、5、7均為只包含胃癌患者，共34例，滿足1.475（M2046）、2.239(M3179)、1.321(M1817)(括號代表相應(yīng)蛋白質(zhì)相對含量，下同)為終節(jié)點(diǎn)1，滿足 1.475（M2046）、2.239(M3179)、1.321（M1752）m/z、 -0.856（1817）為終節(jié)點(diǎn)2，滿足1.475（M2046）、2.239(M3179)、1.798（M1929）為終節(jié)點(diǎn)5，滿足1.475（M2046）、-0.697（M1817）為終節(jié)點(diǎn)7；終節(jié)點(diǎn)3、4、6為正常人，共30例，滿足1.475（M2046）、2.239(M3179)、1.321（M1752）、-

16、0.856（1817）為終節(jié)點(diǎn)3，滿足1.475（M2046）、2.2397(M3179)、1.798（M1929）為終節(jié)點(diǎn)4，滿足1.475（M2046）、-0.697（ M1817）為終節(jié)點(diǎn)7。錯(cuò)誤分組率為1.67%。2.2胃癌患者與健康人的比較 通過對34例胃癌患者和30例健康人血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比較，判別分析顯示其中5個(gè)蛋白質(zhì)峰組合所構(gòu)建的診斷模型（模型）能達(dá)到最佳診斷效果：2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z和1 588m/z，其中質(zhì)荷比為2 046m/z的蛋白質(zhì)峰如圖1所示，可見正常人質(zhì)荷比為2 046m/z的蛋白質(zhì)含量明顯低于胃癌患者，經(jīng)方差分

17、析，差異有顯著性（P0.05）。原始判別的準(zhǔn)確率為93.75%（60/64），特異度94.1%（32/34）， 靈敏度93.3%（28/30），見表1；交叉驗(yàn)證的準(zhǔn)確率為76.56%（49/64），特異度73.5%（25/34）， 靈敏度80.0%（24/30），見表2。交叉驗(yàn)證顯示模型對34例胃癌患者中的25例做出了準(zhǔn)確預(yù)測。表1 模型原始判別的結(jié)果（2.3/期與/期胃癌患者的比較 比較12例/期患者與22例/期患者的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，其中4 665m/z 的單個(gè)蛋白質(zhì)峰的診斷模型（模型）可達(dá)到鑒別/期與/期患者的最佳效果。原始判別，總準(zhǔn)確率94.1%（32/34），特異度91.7%（11/12），

18、 靈敏度95.4%（21/22）；交叉驗(yàn)證結(jié)果，特異度91.7%（11/12），靈敏度86.4%（19/22），總準(zhǔn)確率88.2%（30/34）。3討論胃癌的診斷手段正從癥狀、臨床體檢、胃鏡檢查等經(jīng)典手段向基因診斷、分子生物學(xué)檢測手段發(fā)展1，2，但作為后者重要組成部分之一的胃癌血清腫瘤標(biāo)志物，近年來發(fā)展較緩，不能滿足臨床實(shí)際應(yīng)用的需要。運(yùn)用SELDI?TOF?MS技術(shù)來分析鑒定腫瘤不同于非腫瘤的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的全貌，從而獲得內(nèi)因、外因共同作用下腫瘤發(fā)生發(fā)展的較完整信息5，正是針對目前研究現(xiàn)狀的不足之處做出的有益嘗試，該方法已成功應(yīng)用于卵巢癌以及前列腺癌6,7。在胃癌方面的研究也偶見報(bào)道8,9。判

19、別分析是一種根據(jù)觀察或測量到的若干變量值，來判斷研究對象如何分類的常用統(tǒng)計(jì)分析方法，是應(yīng)用計(jì)算機(jī)進(jìn)行疾病輔助診斷的主要統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)。其基本原理是根據(jù)已知的分類（如屬于胃癌組或是屬于健康人組）和表明特征的變量值（即各蛋白質(zhì)峰的峰值數(shù)據(jù)）建立判別函數(shù)，再將某個(gè)個(gè)體的自變量值回代到判別函數(shù)，得出判別分?jǐn)?shù)或計(jì)算屬于各類的概率，從而判斷該個(gè)體屬于哪一類。本研究過程中的判別分析主要分兩個(gè)步驟進(jìn)行，即原始判別和交叉驗(yàn)證。前者是將所有病例的峰值數(shù)據(jù)建立函數(shù)，再逐一將每個(gè)病例代入函數(shù)進(jìn)行判別；后者則是利用除了某一病例外的其余所有病例的數(shù)據(jù)建立函數(shù)，再把這一未參與函數(shù)構(gòu)建的病例數(shù)據(jù)代入函數(shù)進(jìn)行判別，如此判別每一個(gè)病例。這種交叉驗(yàn)證的方法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上稱為“留一法”，與原始判別相比更為真實(shí)、穩(wěn)定、可靠，所以我們選擇了交叉