中華按蚊多態(tài)微衛(wèi)星DNA位點的篩選和特征研究

1、中華按蚊多態(tài)微衛(wèi)星DNA位點的篩選和特征研究(1)【摘要】  目的： 對中華按蚊多態(tài)的微衛(wèi)星DNA位點進行分離和篩選，并闡明其特征. 方法： 應用中華按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴增放大，克隆并測序，構(gòu)建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫. 在其中挑選合適的微衛(wèi)星位點，建立擴增體系. 應用中華按蚊現(xiàn)場樣本擴增不同的微衛(wèi)星位點，聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點. 結(jié)果： 構(gòu)建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫中包含252條序列，GenBank注冊登記號為EF620047EF620298. 其中，雙核苷酸重復最為常見，三核苷酸重復次之

2、，多核苷酸重復少見；含（CA）和（GT）重復的序列最多，重復次數(shù)最多可達56次；完整序列占35.3%，非完整序列占20.2%，復合序列占18.7%，其余為非典型序列. 設計了22對引物擴增不同的微衛(wèi)星位點，其中20個位點產(chǎn)生特異的PCR產(chǎn)物，PAGE結(jié)果顯示其中15個位點具有多態(tài)性. 結(jié)論： 獲得了中華按蚊新的多態(tài)微衛(wèi)星位點共15個，為中華按蚊群體遺傳和其他相關研究提供了分子標志.  【關鍵詞】  中華按蚊；微衛(wèi)星DNA     0引言     微衛(wèi)星DNA是一類簡單的短核苷酸串聯(lián)重復序列，又稱簡單重復序列，廣泛分

3、布于真核生物的基因組中，每間隔1050 kb即存在一個微衛(wèi)星DNA. 微衛(wèi)星DNA包括核心序列和兩側(cè)的側(cè)翼序列，通常核心序列重復單元長16 bp，重復次數(shù)為1060次，其重復次數(shù)的差異導致微衛(wèi)星DNA具豐富的長度多態(tài)性1-2. 微衛(wèi)星DNA已經(jīng)廣泛應用于研究生物多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、行為生態(tài)和親緣關系等3，是一種理想的的分子標志. 中華按蚊（Anopheles sinensis Wiedemann, 1828）在我國分布廣且種群數(shù)量大，是以往文獻記載中瘧疾和絲蟲病的重要傳播媒介4-5. 本研究擬構(gòu)建中華按蚊的微衛(wèi)星DNA庫并篩選其中多態(tài)的微衛(wèi)星位點，為中華按蚊基因組學研究積累基礎資料，并為其相

4、關研究提供新的分子標志.     1材料和方法     1.1材料構(gòu)建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫的樣本為上海實驗室品系，由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所提供. 現(xiàn)場中華按蚊采自云南思茅（200508，n=10）、云南鹽津（200607，n=10）和湖北武漢（200607：GCGGTACCCGGGAAGCTTGG，SAULB：GATCCCAAGCTTCCGGGTACCGC. 以SAULA為引物，連接產(chǎn)物作為模板PCR擴增，反應液中含PCR緩沖液、2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.8 mol/L引物

5、，0.6 U Taq 酶（上海生工生物工程有限公司）和2 L模板，在熱循環(huán)儀（PTC100，美國ABI公司）上執(zhí)行如下程序：72 5 min后，94 1 min，67 1 min和72 2 min共32個循環(huán)，72延伸5 min. 將擴增產(chǎn)物變性后，與Biotin16dd UTP（瑞士Roche公司）標記的寡核苷酸探針雜交，探針包括：(AAT)17，(GA)25，(CCT)17，(AC)25，(CAG)17，(CAC)5，(TC)10，(GT)8和(TG)18. 用親和素Vectrex Avidin D（英國Vector Labs公司）捕獲并超濾離心（美國Millipore公司）濃縮富集雜交的

6、目的片段. 以富集的核酸作為模板，SAULA為引物擴增，反應體系和程序同前. 隨后，用PCR產(chǎn)物再次雜交、捕獲、濃縮富集和擴增. 將上述擴增產(chǎn)物插入TOPOT載體（美國Invitrogene公司），轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑選含微衛(wèi)星DNA序列的陽性克隆，用四色熒光標記雙脫氧鏈終止法測序（PEABI37702 Christian S, Amos B, Tauze D, et al. Conservation of polymorphilc simple sequence loci in cetacean speciesJ. Nature, 1991, 354: 63-65. 3 樊勇，馬

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