Fos蛋白在血管加壓素誘發(fā)急性心肌缺血大鼠腦內(nèi)的分布

1、Fos蛋白在血管加壓素誘發(fā)急性心肌缺血大鼠腦內(nèi)的分布 【摘要】目的研究與急性心肌缺血功能有關(guān)的神經(jīng)元在大鼠腦內(nèi)的分布。方法股靜脈注射血管加壓素誘發(fā)大鼠急性心肌缺血，用免疫組織化學ABC法，觀察Fos蛋白在腦內(nèi)的表達和分布。結(jié)果Fos陽性產(chǎn)物分布于梨狀皮質(zhì)、伏核、終紋床核、扣帶回、斜角帶核、下丘腦室旁核、視上核、視交叉上核、弓狀核、中央杏仁核、穹窿下器、丘腦室旁核、外側(cè)韁核、中腦中央灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)、腦橋臂旁外側(cè)核、藍斑、延髓內(nèi)臟帶等腦區(qū)，而在大腦白質(zhì)及小腦中無明顯的密集分布區(qū)。結(jié)論心肌缺血誘發(fā)的Fos陽性神經(jīng)元在大鼠腦內(nèi)有著廣泛的分布?！娟P(guān)鍵詞】Fos蛋白；心肌缺血；血管加壓素；免疫組織化學；大鼠

2、【中分類號】R322.81【文獻標識碼】A【文章編號】0529-1356(2000)04-296DISTRIBUTION OF FOS PROTEIN IN RAT BRAIN FOLLOWINGACUTE MYOCARDIOISCHEMIA INDUCED BY VASOPRESSINGE XuSU Chang-junRAO Zhi-renGAO Wen（Institute of Neurosciences,the Fourth Military Medical University,Xian 710032,China）【Abstract】Objective To investigate t

3、he distribution of functional neurons in rat brain following acute myocardioischemia. Methods The expression of Fos protein in rat brain following acute myocardioischemia induced by injecting vasopressin into vena femoralis was studied by the immunohistochemical ABC method. Results The Fos reactive

4、products were distributed in the piriform cortex,accumbens nucleus,bed nucleus of stria terminalis, cingulate gyrus,nucleus of diagonal band, hypothalamic paraventricular nucleus, supraoptic nucleus, suprachiasmatic nucleus, arcuate nucleus, central amygdaloid, subfornical organ, paraventricular tha

5、lamic nucleus, lateral habenular nucleus,ventrolateral part of the central gray,lateral parabrachial nucleus,locus ceruleus,medullary visceral zone.No extensively distribution of Fos protein was found in the white matter and the cerebellum. Conclusion The Fos reactive neurons were distributed extens

6、ively in the rat brain during acute myocardioischemia induced by intravenous injection of vasopressin.【Key words】 Fos; Myocardioischemia; Vasopressin; Immunohistochemistry;Rat早期即刻原癌基因c-fos被認為是神經(jīng)元的一種“第三信使”，當細胞受到刺激時，第二信使進入胞核誘導c-fos基因轉(zhuǎn)錄mRNA，mRNA從胞核進入胞漿合成Fos蛋白，F(xiàn)os蛋白與Jun蛋白結(jié)合形成二聚體，磷酸化并在AP-1的參與下進入胞核激活目的基因的

7、表達并最終對該刺激做出反應1。用原位雜交方法可觀察胞漿內(nèi)的mRNA，免疫組織化學方法則可顯示胞核內(nèi)的Fos蛋白，借以辨別與刺激有關(guān)的功能神經(jīng)元，了解其生理功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)間的關(guān)系。Fos方法已成為目前最常用的機能形態(tài)學方法之一。心肌缺血是臨床的常見病，嚴重者可發(fā)生心絞痛、心肌梗塞等病變，與高血壓一起嚴重影響著人類的生存質(zhì)量。盡管其診斷和治療已有多種方案，且效果較好，但其神經(jīng)調(diào)控機制仍不清楚，與其相關(guān)的功能系神經(jīng)元分布亦缺乏詳盡報道。本實驗以股靜脈注射血管加壓素誘發(fā)急性心肌缺血的大鼠為動物模型，采用免疫組織化學方法，觀察了Fos蛋白在腦中的分布。材料和方法1. 動物模型及切片制備雄性SD大鼠6只，

8、體重180250g，在溫暖、避光、水和食物充足的環(huán)境中飼養(yǎng)1周后，乙醚吸入結(jié)合1%戊巴比妥鈉(40mg/kg體重)腹腔麻醉以減少注射過程中因疼痛掙扎而出現(xiàn)的Fos表達，并記錄心電(ECG)。暴露股靜脈，分3次注入血管加壓素，每次1U，間隔10min,再次記錄ECG，并在動物存活2h后開胸，升主動脈插管。先以100ml生理鹽水快速沖洗血液，隨后用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)灌流固定，取出全腦置于20%蔗糖中至沉底。冰凍切片機切制連續(xù)冠狀切片，片厚30m。2. 免疫組織化學染色按ABC法進行。切片入含0.3% Triton X-100的PBS中室溫浸泡30min,

9、0.01mol/L PBS漂洗10min3次后，于兔抗Fos多克隆抗體(13 000,Santa Cruz)中4放置48h，PBS漂洗10min3次后入生物素結(jié)合的羊抗兔IgG(1500，Sigma)，室溫放置2h，再次漂洗后移至Avidin-Biotin HRP Complex-ABC液(1500，Sigma)中室溫2h，硫酸鎳胺-葡萄糖氧化酶法呈色。常規(guī)貼片、脫水透明、DPX封片，光鏡觀察。3. 對照實驗3.1麻醉對照組：SD大鼠4只，乙醚吸入麻醉后，1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40mg/kg體重)，不手術(shù)，不注射血管加壓素，2h后同前灌流固定、取材、進行Fos免疫組織化學反應。3.2生理鹽水

10、對照組：SD大鼠4只，乙醚-戊巴比妥鈉復合麻醉下，生理鹽水替代血管加壓素以同等方式、同等劑量注入股靜脈，測量ECG，其后步驟同實驗組。3.3免疫組織化學法對照：用PBS取代兔抗Fos多克隆抗體，將部分實驗組切片孵育48h(4)，其他步驟同實驗組。結(jié)果文中所用核團的中英文名稱參照王平宇等的研究2。1. 心電改變實驗組注射血管加壓素前心電無明顯改變(1a)：注射后，心電示ST-T段持續(xù)改變，提示心肌缺血，且心率增快(1b)。生理鹽水對照組心電無缺血改變。 1a注射血管加壓素前大鼠的心電；1b注射血管加壓素后大鼠的心電，示心肌缺血Fig.1a Electrocardiogram(ECG) of th

11、e rat without being injected the vasopressin; 1b,ECG of the rat being injected the vasopressin indicated myocardioischemia.2. Fos陽性胞核分布在血管加壓素誘發(fā)急性心肌缺血情況下，F(xiàn)os陽性胞核見于大鼠腦內(nèi)多個核團和區(qū)域(2)，現(xiàn)分述如下：2.1大腦：嗅腦內(nèi)Fos陽性細胞主要出現(xiàn)在小球?qū)雍蜕奔毎麑樱送馑鑼又幸灿休^密集的分布。皮質(zhì)區(qū)除扣帶回、梨狀皮質(zhì)有Fos陽性細胞中度密集的分布外，其余皮質(zhì)均很稀少。此外，伏核、終紋床核(3)、斜角帶核(4)、Calleja島、杏仁核

12、簇，尤其是中央杏仁核(5)、穹窿下器周緣(6)皆有密集分布。2.2間腦：下丘腦區(qū)域Fos陽性產(chǎn)物密集于下丘腦室旁核(7)、視上核(8)、視交叉上核(9)、弓狀核(10)和正中隆起。第三腦室室周灰質(zhì)、下丘腦視前外側(cè)區(qū)和外側(cè)區(qū)也有Fos陽性細胞的中度密集分布。丘腦室旁核、外側(cè)韁核(11)Fos分布密集。2.3小腦：急性心肌缺血時，大鼠小腦內(nèi)Fos陽性產(chǎn)物無明顯分布密集區(qū)。 2.4腦干：中腦中央灰質(zhì)的腹外側(cè)區(qū)(12)、中縫背核Fos陽性產(chǎn)物中度密集。腦橋臂旁外側(cè)核、藍斑(13)和A5區(qū)有高度密集的Fos分布，背側(cè)背蓋區(qū)中度密集，前庭核簇、中縫核群也有少量分布。Fos陽性產(chǎn)物在延髓內(nèi)的分布極具規(guī)律性，

13、密集區(qū)形成一條背內(nèi)腹外方向伸展的弧形帶，稱為延髓內(nèi)臟帶(MVZ)。具體包括：背內(nèi)側(cè)的孤束核、迷走神經(jīng)背核、最后區(qū)、腹外側(cè)的腹外側(cè)網(wǎng)狀核以及位于兩者之間的中間帶等(14)。值得注意的是在MVZ中間部Fos陽性胞核多位于疑核內(nèi)側(cè)。此外，三叉神經(jīng)旁核、下橄欖內(nèi)側(cè)核帽也有中等程度的Fos表達。3. 實驗組和對照組不同核團中Fos陽性產(chǎn)物的定量比較(附表)從表中數(shù)據(jù)可看出，除嗅腦外，實驗組和對照組Fos陽性胞核在大鼠腦內(nèi)不同核團中的數(shù)量有顯著的差異。附表Fos陽性產(chǎn)物在實驗組及對照組大鼠腦內(nèi)不同核團中的分布Table Distribution of the Fos positive reactive p

14、roducts in the rat brains of the experimental group and the control groups實驗組experimentalgroup麻醉對照anesthesiagroup鹽水對照salinegroup實驗組experimentalgroup麻醉對照anesthesiagroup鹽水對照salinegroup嗅腦rhinencephalon532510547外側(cè)韁核lateral habenular nucleus752012梨狀皮質(zhì) piriform cortex633141外側(cè)臂旁核 lateral parabrachial nucle

15、us2242136扣帶回cingulum gyrus1093743中央灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)ventrolateral part of the central gray952025終紋床核bed nucleus of stria terminals45517藍斑locus ceruleus901644斜角帶nucleus of diagonal band3165692中縫背核dorsal raphe nucleus4534中央杏仁核central amygdaloid9037最后區(qū)area postrema2652015穹窿下器subfornical organ121921孤束核nucleus of s

16、olitary tract76870260視上核supraoptic nucleus1684032中間帶intermediate reticular zone551015視交叉上核suprachiasmatic nucleus80617疑核nucleus ambiguus1535下丘腦室旁核hypothalamic paraventricular nucleus763026腹外側(cè)網(wǎng)狀核ventrolateral reticular nucleus751025 討論血管加壓素是一種九肽，由下丘腦室旁核和視上核神經(jīng)元分泌，經(jīng)下丘腦垂體束被運輸?shù)酱贵w后葉，并作為垂體后葉激素釋放入血。起初人們以為血管

17、加壓素的生理功能是促進腎臟對水的重吸收，故稱之為抗利尿激素。但后來知道它對心血管活動也起重要的調(diào)節(jié)作用。由于血管加壓素的作用主要針對內(nèi)臟小動脈，且一般不能通過血腦屏障，故可以排除其直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。心臟是對缺血最敏感的器官，本實驗從股靜脈注入血管加壓素3，引起大鼠冠狀動脈等血管的痙攣，造成急性心肌供血不足，加之外周阻力增加，導致心臟負荷加重，直接表現(xiàn)為心電的缺血改變。這種來自心臟的缺血信息很快傳入中樞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)過一系列的整合與調(diào)節(jié)，產(chǎn)生相應的應激反應。這種整合及調(diào)節(jié)的過程非常復雜，由多級中樞共同參與。Fos方法自80年代建立以來，已廣泛用于顯示某一刺激傳導的神經(jīng)通路46，雖

18、然其結(jié)果是通過形態(tài)學方法顯示，但在某種程度上反映了一定的功能意義，因而被認為是一種形態(tài)與功能相結(jié)合的指標3。在使用Fos法時，我們除嚴格限制實驗條件外，還設立了嚴格的對照，以保證結(jié)果的特異性。對于嗅腦Fos分布在實驗組和對照組無明顯差異的結(jié)果，我們認為與乙醚吸入麻醉有關(guān)，嗅皮質(zhì)對急性心肌缺血似無直接反應。Dun7在研究心血管反應相關(guān)神經(jīng)元時發(fā)現(xiàn)：失血刺激下，F(xiàn)os陽性產(chǎn)物見于梨狀皮質(zhì)、終紋床核、Calleja核、穹窿下器、杏仁中央核、臂旁核、室旁核、視上核、腦橋A5區(qū)、延髓腹外側(cè)部、孤束核、最后區(qū)以及脊髓中間帶外側(cè)核等；而高血壓條件下，則主要密集于終紋床核、杏仁中央核、臂旁核、孤束核和最后區(qū)。

19、Vahid-Ansari8的研究則表明：急性心肌梗死引起的充血性心力衰竭在發(fā)生24周后Fos相關(guān)基因樣(Fra-LI)物質(zhì)主要見于室旁核、視上核、孤束核、迷走神經(jīng)背核、最后區(qū)，腹外側(cè)的腹外側(cè)網(wǎng)狀核以及位于兩者之間的中間帶等核團。我們在血管加壓素誘發(fā)急性心肌缺血狀態(tài)下得到的實驗結(jié)果基本上包括了以上核團，此外還證實了斜角帶核、藍斑、延髓中間網(wǎng)狀等也參與心血管反應。根據(jù)以往的研究9推測，上述核團的反應不是彼此孤立，而是構(gòu)成以延髓內(nèi)臟帶為中心的神經(jīng)網(wǎng)絡。來自內(nèi)臟的刺激信息經(jīng)迷走神經(jīng)或交感神經(jīng)的傳入纖維直接或間接(經(jīng)脊髓)傳至延髓內(nèi)臟帶，延髓內(nèi)臟帶的相關(guān)神經(jīng)元發(fā)出纖維直接10，11或間接12(經(jīng)臂旁核、

20、中腦中央灰質(zhì)換元)投射至前腦邊緣系(梨狀皮質(zhì)、終紋床核、杏仁中央核等)和下丘腦13(室旁核、視上核等)。前腦邊緣系和下丘腦也發(fā)出纖維直接或間接(經(jīng)臂旁核、中腦中央灰質(zhì)換元)投射至延髓內(nèi)臟帶，延髓內(nèi)臟帶也有纖維投射至脊髓中間帶外側(cè)核(交感神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元)或發(fā)出副交感節(jié)前纖維支配心臟。由此可見，當急性心肌缺血時，機體的應激反應是受到一個復雜的中樞神經(jīng)網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)。本文314見插第3，4頁3終紋床核內(nèi)的Fos陽性神經(jīng)元。BST.終紋床核LV.側(cè)腦室400Fig.3 Fos-positive neurons in the bed nucleus of stria terminalis.BST, bed

21、nucleus or stria terminalis LV,lateral ventricle 4004斜角帶核內(nèi)的Fos陽性神經(jīng)元。HDB.斜角帶核水平部VDB.斜角帶核垂直部160Fig.4 Fos-positive neurons in the nucleus of diagonal band.HDB,horizontal part of the nucleus of diagonal band VDB,vertical part of the nucleus of diagonal band 1605杏仁核簇內(nèi)的Fos陽性神經(jīng)元。OPT.視束CE.杏仁中央核160Fig.5 Fos-

22、positive neurons in the amygdaloid nuclei.OPT,optic tract CE,central amygdaloid nuclei 1606穹窿下器內(nèi)的Fos陽性神經(jīng)元。SFO.穹窿下器160Fig.6 Fos-positive neurons in the subfornical organ. SFO,subfornical organ 1607下丘腦室旁核的Fos陽性神經(jīng)元。3V.第三腦室PA.下丘腦室旁核400Fig.7 Fos-positive neurons in the hypothalamic paraventricular nucleu

23、s.3V,3th ventrical PA,hypothalamic paraventricular nucleus 4008視上核內(nèi)的Fos陽性神經(jīng)元。OPT.視束SO.視上核160Fig.8 Fos-positive neurons in the supraoptic nucleus.OPT,optic tract SO,supraoptic nucleus 1609視交叉上核的Fos陽性神經(jīng)元。3V.第三腦室SCH.視交叉上核400Fig.9 Fos-positive neurons in the suprachiasmatic nucleus.3V,3th ventrical SCH,

24、suprachiasmatic nucleus 40010弓狀核的Fos陽性神經(jīng)元。ARC.弓狀核160Fig.10 Fos-positive neurons in the arcuate nucleus.3V,3th ventrical ARC,arcuate nucleus 16011外側(cè)韁核的Fos陽性神經(jīng)元。3V.第三腦室LHB.外側(cè)韁核160Fig.11 Fos-positive neurons in the lateral habenular nucleus.3V,3th ventrical LHB,lateral habenular nucleus 16012中腦中央灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)

25、的Fos陽性神經(jīng)元。AQ.中腦導水管CGL.中腦中央灰質(zhì)外側(cè)區(qū)160Fig.12 Fos-positive neurons in the ventrolateral part of central gray.AQ,mesencephalic aqueduct CGL,lateral part of central gray 16013臂旁外側(cè)核及藍斑內(nèi)的Fos陽性神經(jīng)元。LC.藍斑LPB.臂旁外側(cè)核160Fig.13 Fos-positive neurons in the lateral parabrachial nucleus and locus ceruleus.LC,locus ceru

26、leus LHB,lateral parabrachial nucleus 16014延髓內(nèi)臟帶中的Fos陽性神經(jīng)元。AP.最后區(qū)NTS.孤束核VLRT.腹外側(cè)網(wǎng)狀核80Fig.14 Fos-positive neurons in the medullary visceral zone.AP,area postrema. NTS,nucleus of solitary tract VLRT,ventrolateral reticular nucleus 80【基金項目】國家自然科學基金資助項目(39770251)【作者簡介】葛煦(1973)，男(漢族)，四川成都人，碩士葛煦（第四軍醫(yī)大學神經(jīng)科

27、學研究所，西安710032）宿長軍（第四軍醫(yī)大學神經(jīng)科學研究所，西安710032）饒志仁（第四軍醫(yī)大學神經(jīng)科學研究所，西安710032）高文（第四軍醫(yī)大學神經(jīng)科學研究所，西安710032）參考文獻1張遐，鞠躬.c-fos癌基因的誘發(fā)和顯示一種反映神經(jīng)功能通路的新方法J.生理科學進展，1991，22(4)：299303.2王平宇，張鳳真.大鼠腦讀片提要及譜M.西安：西北大學出版社，1995：223250.3徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：713714.4DiNardo LA,Travers JB.Distribution of Fos-like immuno

28、reactivity in the medullary reticular formation of the rat after gustatory elicited ingestion and rejection behaviorsJ.J Neurosci,1997,17(10):3826-3839.5McKinley MJ,Colvill LM,Giles ME,et al.Distribution of Fos-immunoreactivity in rat brain following a dipsogenic dose of captopril and effects of angiotensin receptor blockadeJ.Brain Res,1997,747(1):43-51.6Carstens E,Saxe I,Ralph R.Brainstem neurons expressing c-fos immunoreactivity following irritant chemical stimulation of the rats tongueJ.Neuroscience,1995,69(3)