protocol-轉(zhuǎn)染+熒光修改

1、轉(zhuǎn)染實驗:1、 消化細(xì)胞,加入 2ml 胰酶, 37°孵育 5min , 4ml 完全培養(yǎng)基終止,吹打。2、 收細(xì)胞, 1000rpm ,離心 1min.3、 細(xì)胞接種在 24孔板中,每孔 20000個, 500ul 完全培養(yǎng)基培養(yǎng),待 80%融 合開始轉(zhuǎn)染。4、 轉(zhuǎn)染前 2小時更換培養(yǎng)基,換成 OPTI-MEM ,孵育 2h ,饑餓處理 .5、 DNA :lipo=0.5ug :2ul (lipo 探索 4個梯度 ,分別稀釋于 25ul MEM 中,混 合 DNA 和 lipo (50ul ,室溫孵育 15min ,加入到細(xì)胞中。做 3個副孔。 質(zhì)粒稀釋:Basic:0.3790

2、ug/ulR :0.3276 ug/ulTFF1:0.3712 ug/ulERE :0.4378 ug/ulAP-1:0.3778 ug/ul雙突變:0.4363 ug/ul構(gòu)建基因與 R 比例 =10:1,取 1ul R加入到 9ul MEM中,進(jìn)行 10倍稀釋Basic+R組:1.19 ul的 basic 加入到 11.31 ul MEM中, 1.53ul R加到 10.97ul MEM中,混合,室溫 15min 。TFF1+R組:1.22ul TFF1加到 11.28 ul MEM中, 1.53ul R加到 10.97ul MEM中,混 合,室溫 15min 。ERE+R組:1.03ul

3、 ERE加到 11.47ul MEM中, 1.53ul R加到 10.97ul MEM中, 混合, 室溫 15min 。AP1+R組:1.20ul AP-1加到 11.3ul MEM中, 1.53ul R加到 10.97ul MEM中, 混合, 室溫 15min 。ERE+AP1+R組:1.04ul 加到 11.46ulMEM 中, 1.53ul R 加到 10.97ul MEM 中,混 合,室溫 15min 。6、 37°孵育 6h 后更換有血清有雙抗培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育 24h 。 雌激素刺激:轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞孵育 24h 后,用 10-6、 10-12兩個濃度刺激細(xì)胞,每孔 500ul

4、 ,孵育 24h 。開始測定熒光實驗。測定熒光實驗:1、 吸取細(xì)胞上清液, 每孔加入 150ul 細(xì)胞裂解液, 輕輕吹打, 使細(xì)胞充分裂解。 然后, 15000g 離心 3min ,取上清用于測定,加入到不透光白色酶標(biāo)板中,每 孔加入 100ul 。2、 融解螢火蟲熒光素酶檢測試劑和 Renilla 熒光素酶檢測緩沖液,并達(dá)到室溫。 Renilla 熒光素酶檢測底物(100X 放在冰盒上備用。3、 首先,每孔加入 100ul 螢火蟲 熒光素酶檢測試劑,輕輕混勻,測定其 RLU , 以 Basic+R組的細(xì)胞裂解液為空白對照。4、 Renilla 熒光素酶檢測底物(100X 按照 1:100的比例用檢測緩沖液稀釋,每 孔加入 100ul 稀釋液。本次試驗,取 20ul Renilla熒光素酶檢測底物(100X , 加入 2ml 緩沖液,充分混合均勻,每孔加入 100