實時熒光定量PCR的研究進展及應(yīng)用-

1、2007年4月第15卷第2期中國實驗動物學報ACT A LABORAT ORIUM ANI M A LIS SCIE NTIA SINICA Apr.,2007V ol.15N o.2研究進展實時熒光定量PCR 的研究進展及應(yīng)用許琰,叢,魏強(中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物研究所,北京100021【摘要】實時定量PCR (real 2time PCR 的應(yīng)用范圍非常廣泛,包括mRNA 表達的研究、DNA 拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性(S NPs 的測定等。由于傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)不能準確定量,使其在實際應(yīng)用方面受到很大限制,因此,對PCR 產(chǎn)物進行準確定量,尤其是病毒性病原的動態(tài)監(jiān)控,成

2、為迫切需要?！娟P(guān)鍵詞】聚合酶鏈反應(yīng);核酸擴增技術(shù);應(yīng)用;病毒【中圖分類號】R319.9【文獻標識碼】A 【文章編號】100524847(2007022*Development of R eal 2Time Polymerase Chain R eaction andIts Application .A R evie wX U Y an ,C ONG Zhe ,WEI Qiang(Institute of Laboratory Aniaml Sciences ,Chinese Academy of Medical Sciencesand Peking Union Medical C ollege

3、 ,Beijing 100021,China 【Abstract 】The traditional polymerase chain reaction (PCR technique played a very im portant role in detection of nuclearacids.Recently ,based on PCR ,the real 2time PCR that can quantitate the products of PCR have been developed and applied in various fields ,especially in de

4、tection of viral pathogens.In this review ,the real 2time PCR technique and its application will be introduced.【K ey w ords 】real 2time PCR ;Nuclear acids am plification techniques ;Application ;Virus基金項目中國CIPRA 項目,美國NIH 資助,項目號U19AI51915204。作者簡介許琰,碩士研究生,從事實驗動物病毒分子生物學研究工作。通訊作者魏強,教授,研究方向:實驗動物病毒學。E 2ma

5、il :weiqiang0430s 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction ,PCR 技術(shù)是1985年問世的一項基因檢測技術(shù)。由于PCR 簡便易行、靈敏度高等優(yōu)點,該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。但是,由于傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)不能準確定量,且操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點,使其在臨床上的應(yīng)用受到限制1。熒光定量PCR 方法是根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence res onance energy trans fer ,FRET 原理,設(shè)計相應(yīng)的熒光標記核酸探針,通過PCR 反應(yīng)對相應(yīng)靶DNA 進行均相定性定量測定的技術(shù),根據(jù)檢測中所使用的熒光探針分類,目前

6、已經(jīng)開發(fā)出T aqMan 、M olecular Beacon 、Scorpion 、LightCycler 、Single 2labeled probe 、Res onSense 、Angler 以及雙鏈探針等相關(guān)技術(shù)。1原理Real 2time PCR 技術(shù),是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR 反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA 拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,最終PCR 反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板,從而進入平臺期。在傳統(tǒng)的PCR 中,常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR 反應(yīng)的最終擴增

7、產(chǎn)物,因此,用此終點法對PCR 產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real 2time PCR 中,對整個PCR 反應(yīng)擴增過程進行了實時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關(guān)的熒光信號,隨著反應(yīng)時間的進行,監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR 反應(yīng)早期,產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別,而后熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期,因此可以在PCR 反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點上來檢測PCR 產(chǎn)物的量,并且由此來推斷模板最初的含量2。為了便于對所檢測樣本進行比較,在real2time PCR反應(yīng)的指數(shù)期,首先需設(shè)定一個熒光信號的閾值,一般這個閾值(threshold是以PCR 反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光

8、信號作為熒光本底信號。如果檢測到的熒光信號超過閾值被認為是真正的信號,它可用于定義樣本的閾值循環(huán)數(shù)(Ct。Ct值的含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,因此只要獲得未知樣品的Ct 值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。2各種熒光定量方法目前real2time PCR所使用的熒光化學方法主要有五種,分別是:DNA結(jié)合染色,水解探針,分子信標,熒光標記引物,雜交探針,它們又可分為擴增序列特異和非特異的檢測兩大類。擴增序列非特異性的檢

9、測方法的基礎(chǔ)是DNA 結(jié)合的熒光分子,如SY BR G reen等熒光染料3。Real2time PCR發(fā)展早期就是運用這種最簡單的方法,在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SY BR G reen熒光染料,SY BR G reen熒光染料特異性地摻入DNA 雙鏈后,發(fā)射熒光信號。熒光染料的優(yōu)勢在于它能監(jiān)測任何dsDNA序列的擴增,不需要探針的設(shè)計,使檢測方法變得簡便,同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合,因此它也能與非特異的dsDNA(如引物二聚體結(jié)合,使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號,但可以通過分析產(chǎn)物的熔點曲線來排除非特異擴增。擴增序列特異性的檢測方法是在PCR反應(yīng)中利用標

10、記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物,主要有以下幾種。T aqMan探針是一段5端標記報告熒光基團(R,3端標記淬滅熒光基團(Q的寡核苷酸,其序列與模板DNA中的一段完全互補。報告熒光基團(R如FAM,TET,VIC,JOE,HEX,淬滅熒光基團為T AMRA(Q。當探針單獨存在時,由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生,R的熒光受到Q的淬滅。在PCR過程中,由于T aq DNA酶的523外切酶活性的作用,使探針的5端的R被切斷,加大了與Q的距離而使熒光恢復4。另一種熒光探針single labeled probe technology與T aqMan技術(shù)類似。不同之處在于其寡核苷酸探針只有一個熒光

11、發(fā)射基團,該基團是有帶有熒光素的鉍螯合物構(gòu)成,并標記在寡核苷酸探針的5端,而3末端具有2個堿基不與模板配對,以保證探針的穩(wěn)定性。在游離的狀態(tài)下鉍螯合物發(fā)出的熒光比連接單鏈寡核苷酸時強,當探針退火與模板互補配對時,在DNA聚合酶的523外切酶的作用下,探針被切斷鉍螯合物發(fā)出較強的熒光信號,從而實現(xiàn)對目的基因的分析。分子信標技術(shù)由T yagi和K rammer提出。分子信標長約25個核苷酸,在空間結(jié)構(gòu)上呈發(fā)夾型,由環(huán)莖桿組成。環(huán)序列與靶DNA序列互補,長約18 20個核苷酸,莖桿部分長約57個核苷酸,由G C 含量較高的與靶序列無關(guān)的互補序列構(gòu)成。分子信標的5端標記報告基團,3端標記淬滅基團。當分

12、子信標處于自由狀態(tài)時,發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩個末端靠近使F與Q靠近。F被淬滅。當有靶序列存在時,分子信標與靶序列結(jié)合,使分子信標的莖桿區(qū)被拉開。此時R熒光不能被淬滅,可檢測到熒光。常用的熒光2淬滅分子對有C oumarin2DABCY L,E ADNS2 DABCY L,FAM2DABCY L,TET2DABCY L,T AMRA2 DABCY L,T exasRed2DABCY L等。建立在分子信標技術(shù)基礎(chǔ)上的探針技術(shù)有Am plifluor,Sunrise, Am plisens or,Scorpion等5-7。其中Scorpion技術(shù)廣泛應(yīng)用。其設(shè)計為在分子信標的3端通過連接臂連接一段引物。擴增出

13、包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的PCR產(chǎn)物。包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的PCR產(chǎn)物在退火時形成分子內(nèi)雜交,發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞,兩個基團之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,從而發(fā)出熒光。雙鏈探針又稱為復合探針,由互補的兩條鏈構(gòu)成8-9。長鏈的5端標記報告基團,3端磷酸化,短鏈的3標記淬滅基團。沒有靶核苷酸存在時,兩條鏈形成復合體,熒光被淬滅。當有靶序列存在時,帶有報告熒光基團的長鏈探針先和靶結(jié)合,發(fā)出熒光。雜交探針與其他種類的探針相比比較容易設(shè)計,每段探針是單標記的。目前有三種設(shè)計形式10-14。探針探針形式:這種方式由兩條相鄰的探針構(gòu)成,熒光供體標記在一條探針上,另一條相鄰的探針標記一長波長的熒光受體分子。兩條探針均與靶序列特異性結(jié)合,且

14、結(jié)合后的兩條探針均與模板相結(jié)合,供受體熒光之間發(fā)生了FRET能量轉(zhuǎn)移,可以檢測到供體熒光強度的減弱,受體熒光強度的增強,供受體熒光基團之間的間距為1堿基時最為合理。在間距為510堿基時熒光信號強度降低50%,但在間距1525堿基時仍能檢測出信號。引物探針形式:由一條單標記引物和一條單標記探針構(gòu)成。標記引物可用于PCR擴增。距引物3端3 6個堿基的T堿基經(jīng)過修飾可用于熒光染料的標記。另一條探針的3端標記相應(yīng)的熒光可與熒光引物擴增出的鏈相雜交。在雜交時供體熒光基團和受體熒光基團在相反的鏈上相距46個堿基。G 淬滅探針形式:只用一條單標記的探針。在雜交時可以觀察到熒光的增強或減弱。例如,在探針雜交時

15、FAM或BODIPY2F L在接近G核苷酸時可發(fā)生熒光淬滅15。這種探針可以在3或5端標記。探針設(shè)計成標記的熒光化合物與靶DNA上的G重合。靶DNA上相鄰的G會增強淬滅的效果。但第一個位置重疊的G是最重要的。以上的雜交探針,5端標記者其3端必須磷酸化以阻止在PCR中鏈的延伸。在雜交探針中供體熒光基團可采用FAM、FIT C、受體可采用LC2RE D640、CY5、LC2RE D705。除以上各種熒光探針外,一些探針如Light2Up、Cyclicons、LUX見之報道16-18。從目前國內(nèi)外的科研及臨床應(yīng)用情況來看,以T aqMan,分子信標, Scorpion以及雜交探針應(yīng)用較為廣泛。在國內(nèi)

16、外已開發(fā)成功并投放市場的PCR檢測試劑盒中,所運用的主要是T aqMan、分子信標以及雜交探針這三種技術(shù)。Scorpion是一種改進型的分子信標19。由于其工作原理是擴增后的單個分子內(nèi)的雜交,因此有著更好的動力學和熱力學特性。相比上述三種需分子間雜交的探針,Scorpion雜交速度極快,更適合快速熱循環(huán)PCR。但是由于其合成的難度比較高,價格比較昂貴,限制了其廣泛的應(yīng)用。目前對T aqMan技術(shù)的改進也在進行中,Dmitri Proudinkov將淬滅劑從鏈3端移至鏈的中間,可以將靈敏度提高30倍以上。同時一種可以替代FAM的新的熒光染料Alexa Fluor488及非熒光和金屬淬滅劑也已應(yīng)用

17、于T aqMan技術(shù),可使其靈敏度進一步提高。3實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用Real2time PCR的應(yīng)用范圍很廣泛,包括mRNA 表達的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性(S NPs的測定等。以下就目前real2time PCR在易位基因的檢測,細胞因子的表達分析,腫瘤耐藥基因表達的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測中的應(yīng)用作一概述。3.1微小殘留病變的檢測腫瘤疾病尤其是血液的惡性腫瘤常伴有特異性基因的易位,這種易位往往可以作為監(jiān)測臨床治療效果的一種腫瘤標志。雖然在過去的幾十年里治療方案的改進已大大地延長了患者的生存期,但是緩解期的患者仍存在復發(fā)的危險性。因此微小殘留病變(MRD的檢測對于進

18、一步調(diào)整治療方案是至關(guān)重要的。Real2time PCR的應(yīng)用正成為檢測腫瘤微小殘留分子標志的一種必備的研究工具。通過對腫瘤融合基因的定量測定能指導臨床對患者實行個體化的治療。3.2細胞因子的表達分析細胞因子是調(diào)節(jié)蛋白,它通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)(包括淋巴細胞活化、增殖、分化、生存和凋亡在免疫系統(tǒng)中起著核心作用。許多不同類型的細胞都能分泌這種低分子量的蛋白質(zhì),其中包括淋巴細胞、抗原遞呈細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞。細胞因子可被分為不同的組:白介素(I L21I L223,干擾素(IFN2,IFN2等,集落刺激因子(CSF,腫瘤壞死因子(T NF,腫瘤生長因子(TG F2等和化學因子(MCP21

19、,MIP21等20。為了闡明在許多炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病和器官移植排異中的免疫致病途徑,細胞因子mRNA表達譜的可靠定量是很重要的。盡管被檢樣本中細胞因子含量往往極低,然而real2 time反轉(zhuǎn)錄PCR(RT2PCR以其高敏感性和準確性在細胞因子的定量中越來越受到青睞。3.3腫瘤耐藥基因表達的研究對化療藥物的耐藥是治療腫瘤患者的主要障礙。由于耐藥限制了許多腫瘤的成功治療,因此研究腫瘤細胞的耐藥機制就變得十分重要。目前研究中發(fā)現(xiàn)主要的耐藥機制有:ATP結(jié)合基因超家族(ATP2binding cassette superfamily的膜轉(zhuǎn)運蛋白介導的耐藥21,酶介導的耐藥,凋亡基因介導的耐藥等

20、22。多藥耐藥(MDR是多因素、多種機制共同作用的結(jié)果。Real2time反轉(zhuǎn)錄PCR(RT2PCR是了解腫瘤耐藥,指導臨床治療策略的有用手段,它能觀測用藥前后及復發(fā)時腫瘤細胞的耐藥基因mRNA表達變化,從而及時調(diào)整治療方案和評價疾病的預后。3.4病毒感染的定量監(jiān)測擴增技術(shù)的發(fā)展使得對病毒的定性或定量檢測的能力隨之提高,也使研究病毒載量和疾病進展的關(guān)系成為可能。Real2time PCR是主要被運用于科研和診斷領(lǐng)域的擴增技術(shù),它不僅能對病毒定性,而且由于其實驗的批間和批內(nèi)差異小,重復性好,因此能方便、快速、靈敏、準確地定量病毒DNA或RNA的序列,更重要的是從中可以動態(tài)地研究在整個病程中潛在病

21、毒的復活或持續(xù),從而使臨床醫(yī)生和病毒學家能檢測臨床的變化,如抗病毒治療的效果,耐藥變異的出現(xiàn)等。目前我們實驗室通過熒光定量PCR技術(shù)來檢測SI VSHI VS AI DS恒河猴模型的病毒RNA載量,在SI VSHI VS AI DS恒河猴模型研究中,最重要是確切了解病毒和疾病發(fā)展過程,因此病毒載量的有效測定非常重要。一直以來,我們只有定性PCR這一種方法。PCR方法的敏感性是很高的,但不能精確定量,只能得出“有或無”的結(jié)論,無法依據(jù)定性PCR 的結(jié)果判斷出病毒的走勢,不能真實反映艾滋病模型猴(S AI DS的病毒感染狀態(tài)。尤其現(xiàn)在開發(fā)的許多抗艾滋病藥物和治療性疫苗都是針對病毒感染過了急性期,進

22、入平臺期這個疾病階段的,所以這個方法在這個階段應(yīng)用價值不大。因此,實時熒光定量的方法檢測猴免疫缺陷病毒(SI VSHI V載量顯得非常重要。熒光PCR技術(shù)自建立以來,發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛,表明出明顯優(yōu)勢。近些年來,許多科研工作者基于熒光PCR的基本原理對熒光PCR技術(shù)進行不斷深入的研究和改進,使熒光PCR技術(shù)得到了進一步的完善,并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出了許多新的熒光PCR 技術(shù)。隨著熒光PCR技術(shù)的不斷發(fā)展該技術(shù)將在生物學、醫(yī)學基礎(chǔ)研究以及實驗動物學等廣泛的領(lǐng)域中得到更加廣泛的推廣應(yīng)用。參考文獻1Chung HW.Reverse transcriptase PCR(RT2PCRand quantita

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