活血通脈靈對異丙腎上腺素致心肌缺血大鼠VEGF、bFGF表達的影響

1、活血通脈靈對異丙腎上腺素致心肌缺血大鼠VEGF、bFGF表達的影響                    作者：杜英 淮丁華 楊藝全 商小涓 【摘要】  目的探討活血通脈靈(HXTML)對異丙腎上腺素(ISO)所致心肌缺血大鼠血管內皮生長因子(VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)表達的影響。方法將50只Wistar雄性大鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，藥物對照組及活血通脈靈大劑量治療組

2、(HXTMLmax)和活血通脈靈小劑量治療組(HXTMLmin)，采用ISO 復制心肌缺血模型，ABC染色檢測VEGF和bFGF表達量。結果空白對照組VEGF、bFGF少量表達，其余各組均有不同程度表達，表達量較空白組高。二者在HXTMLmax組表達量最高，HXTMLmin組次之，與模型組及藥物對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。結論活血通脈靈能促進缺血心肌表達VEGF，bFGF，有一定的促血管生成作用。 【關鍵詞】  活血通脈靈; 心肌缺血; 異丙腎上腺素; 血管內皮生長因子; 堿性成纖維細胞生長因子 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)已成為威脅人類健康的最常見的疾病之一，心肌缺血是該病基

3、本的病理生理過程。目前，對于本病的治療方法主要有藥物治療、介入治療、外科手術等，均有其優(yōu)勢和局限性，而促血管生成療法也是當前一項研究熱點，其內容主要為血管內皮生長因子(VEGF)或成纖維細胞生長因子(FGF)的蛋白治療和基因治療。傳統(tǒng)的中醫(yī)藥學對于本病在病因病機和辨證治療等方面也積累了豐富的經驗。 中藥方劑活血通脈靈(HXTML)是以傳統(tǒng)氣血理論為基礎，經多年實踐總結出來的具有防治冠心病心肌缺血作用的方劑。本研究采用免疫組織化學法，初步探討活血通脈靈對異丙腎上腺素(ISO)所致心肌缺血大鼠心肌VEGF, bFGF表達的影響。 1 材料與儀器 1.1 動物選用Wistar雄性大鼠50只，體質量2

4、00220 g，清潔級，購自河北省實驗動物中心，動物合格證編號：DK0505-0027。在通風、溫度、濕度適宜的動物室內常規(guī)飼養(yǎng)。 1.2 藥物活血通脈靈(丹參、元胡、柴胡、枳殼、當歸、赤芍、川芎、檀香)所需中藥材均購自河北醫(yī)科大學中醫(yī)院，并由醫(yī)院制劑室制成湯劑。大劑量組每毫升藥液含生藥4.7 g，小劑量組每毫升藥液含生藥2.35 g。鹽酸異丙腎上腺素(ISO)注射液：上海禾豐制藥有限公司生產，批號：5E20002，規(guī)格1 mg/2 ml;腸溶阿斯匹林，石家莊制藥集團生產，批號：070617。 1.3 試劑VEGF鼠多克隆抗體，批號：11064;生物素標記羊抗小鼠IgG，批號：50481613

5、;bFGF兔多克隆抗體，批號：K1504;生物素標記羊抗兔IgG，批號：50581654;DAB顯色劑，批號：41281194。以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。    1.4 儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱：HHB11360型，天津三水科學儀器有限公司產;LEICA切片機RM2125型，德國產;恒溫式附貼切片展片儀ZHPY-型，河北醫(yī)學院提供;雙目生物攝影顯微鏡XSZ-HS型，日本產;高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)HPIAS-1000型，同濟醫(yī)科大學千屏影象工程公司產。 2 方法 2.1 動物分組及給藥方法采用隨機數(shù)字表法，將50只Wistar大鼠分為5組，

6、即空白對照組、模型對照組、藥物對照組、活血通脈靈大劑量治療組(HXTMLmax)和小劑量治療組(HXTMLmin)，每組10只，先適應性喂養(yǎng)7 d。實驗前用20%烏拉坦5 ml/kg腹腔注射麻醉后，記錄肢體導聯(lián)心電圖，ST段接近等電位線，T波無低平或高聳者即可入選?？瞻捉M和模型組每次給予10 ml/kg的生理鹽水，藥物對照組給予腸溶阿斯匹林16.6 mg/kg，用生理鹽水配制成等體積混懸液;活血通脈靈大劑量治療組和小劑量治療組分別給予含生藥47，23.5 g/kg湯劑, 以上液體及藥物的給藥容積為10 ml/kg，1次/d，連續(xù)14 d。 2.2 復制模型方法參照文獻1，自第12天灌胃后2 h

7、，除空白對照組外，其余4組大鼠均皮下注射異丙腎上腺素5 mg/kg復制心肌缺血模型，空白對照組皮下注射等容積生理鹽水，1次/d，連續(xù)3 d。 2.3 VEGF、bFGF免疫組化染色各組大鼠均在末次皮下注射后45 min取心尖部心肌組織，生理鹽水沖洗，40 g?L-1甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制成4 m切片，石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH=7.4)沖洗3次，每次35 min，每張切片加50 l過氧化物酶阻斷溶液，室溫下孵育10 min;PBS沖洗3×5 min;加50 l的非免疫性動物血清，室溫下孵育5 min;分別加50 l VEGF鼠多克隆抗體(一抗)或bFGF兔多克隆

8、抗體(一抗)，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3×5 min;分別加50 l生物素標記的第二抗體(VEGF為羊抗小鼠IgG，bFGF為羊抗兔IgG)，室溫下孵育10 min;PBS沖洗3×5 min，加50 l鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min;PBS沖洗3×5 min;加100 l新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察510 min;自來水沖洗，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察，VEGF、bFGF陽性染色表現(xiàn)為心肌細胞胞漿，胞核內散在棕褐色顆?；驁F塊。根據(jù)Weidner法，每個標本選兩張片，隨機選取10個高倍視野，計數(shù)100個同類細胞中的陽性細胞

9、數(shù)。 2.4 數(shù)據(jù)處理所有實驗數(shù)據(jù)用±s表示。用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，不同組間用單因素方差分析。 3 結果 3.1 VEGF表達空白對照組VEGF少量表達，其余各組均有不同程度表達，表達量較空白組高(P<0.05或P<0.01)。VEGF在活血通脈靈大劑量治療組表達量最高，小劑量治療組次之，與模型組及藥物對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。藥物對照組表達量與模型組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1及圖15)。    3.2

10、bFGF表達空白對照組bFGF少量表達，其余各組均有不同程度表達，其中模型組與空白組相比表達量較高 (P<0.05)，其余各組表達量顯著增高(P<0.01)?；钛}靈大劑量治療組及小劑量治療組表達量高于模型組及藥物對照組(P<0.01)，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，藥物對照組表達量與模型組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1及圖610)。圖1 VEGF在空白對照組大鼠 圖2 VEGF在模型對照組大鼠心肌組織中的表達(400×) 心肌組織中的表達(400×)圖3 VEGF在藥物對照組大鼠 圖4 VEGF在活血通脈靈大劑量治療心

11、肌組織中的表達(400×) 組大鼠心肌組織中的表達(400×)圖5 VEGF在活血通脈靈小劑量治療 圖6 bFGF在空白對照組大組大鼠心肌組織中的表達(400×) 鼠心肌組織中的表達(400×)圖7 bFGF在模型對照組大鼠 圖8 bFGF在藥物對照組大鼠心肌組織中的表達(400×) 心肌組織中的表達(400×)圖9 bFGF在活血通脈靈 圖10 bFGF在活血通脈靈大劑量治療組大鼠心肌組 小劑量治療組大鼠心肌組織中的表達(400×) 織中的表達(400×)表1 VEGF和bFGF在各組大鼠心肌組織中陽性表達細胞數(shù)

12、的比較 4 討論 冠狀動脈血管的重建是治療缺血性心臟病最有效和最根本的方式，經典的方法包括血管溶栓、再通、血管成形、冠狀動脈搭橋等。但以上治療手段只能解決心肌供血問題，卻不能修復已壞死的心肌細胞，并且相當一部分患者療效欠佳或并不適合上述療法。20世紀末人們提出了血管新生(Angiogenesis)治療方法，即所謂的“分子搭橋術”，它是指應用藥物、基因治療或其它新治療手段促進冠脈循環(huán)的血管新生，即通過刺激心肌缺血區(qū)小血管生長和側支循環(huán)形成,以減輕心肌缺血，防止細胞壞死，預防和延緩缺血性心臟病，改善患者的臨床癥狀和預后。目前，促進缺血心肌區(qū)域側支循環(huán)的建立健全和動脈血管的新生，即治療性血管生成，是

13、國際心血管病學界的研究熱點，其主要內容為血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等的蛋白治療和基因治療。VEGF是內皮細胞特異性的促有絲分裂原，屬分泌性的糖蛋白，有促進內皮細胞增生，增強血管通透性，加速新血管形成的作用2。在心肌梗死及心肌缺血的發(fā)展過程中，缺血缺氧可誘發(fā)VEGF進入心肌間質，參與體內缺血心肌側支血管的生成3。體內和體外實驗發(fā)現(xiàn)VEGF表達升高是心肌細胞對缺血和/或缺氧作用的適應性反應，表明VEGF不僅在生理狀態(tài)下調節(jié)新血

14、管形成，還能在病理狀態(tài)下的適應性新生血管形成中起作用，推測給予外源VEGF可以加速心肌新血管形成，提高側支血流，從而改善心肌缺血狀態(tài)。林欣等4總結了VEGF用于心肌梗塞后治療的可行性依據(jù)，即VEGF可促進側支循環(huán)早期重建和預防經皮冠狀動脈腔內成形術(PTCA)后再狹窄。VEGF在應用時也有其不利影響，如它有可能參與粥樣斑塊的形成和發(fā)展，刺激靶器官以外的血管新生，包括眼底的血管新生和刺激隱潛的腫瘤。另外，其蛋白價值昂貴，不易制備，體內半衰期短，基因治療的靶向性和安全性需要進一步研究。    bFGF是一種強的血管源性生長因子，可刺激成纖維細胞，血管內皮細胞

15、，血管平滑肌細胞及神經細胞的生長，是血管新生的必要條件5。正常心肌中可見少量bFGF表達，缺血缺氧可誘導bFGF表達上調。近年發(fā)現(xiàn)，該因子對缺血/再灌注心肌損傷具有明顯的拮抗作用6。Miyataka等7開胸結扎犬冠脈左前降支制成急性心肌梗死模型，并向缺血心肌內多點注射bFGF 300 g，4周后發(fā)現(xiàn)非梗死區(qū)域心肌血流增加，梗死面積縮小。其他研究證實，外源性的bFGF可以促使心肌缺血和梗死區(qū)域的血管新生和側支循環(huán)形成8。總之，bFGF應用于冠心病治療的基礎與臨床研究已取得了很大進展，但是這些研究大多還處于基礎實驗向臨床過渡的初期階段，bFGF應用的給藥途徑，劑量，安全性問題還有待深入研究。 面對

16、機遇，中醫(yī)藥在研究促血管生成方面有其獨特的優(yōu)勢，即安全性、作用多靶點性、方便性和無創(chuàng)性。然而這方面研究還存在著很大空缺。本實驗的目的在于對理氣活血中藥在促血管生成機制方面做初步探討。 活血通脈靈由丹參、元胡、柴胡、枳殼、當歸、赤芍、川芎、檀香8味中藥組成?，F(xiàn)代中藥藥理研究證實，丹參素能擴張冠狀動脈，改善微循環(huán)及細胞缺血缺氧所致的代謝障礙;另外，丹參能加強心肌收縮力，而不增加心肌耗氧量，此作用隨用藥時間而增強9;元胡能擴張冠狀動脈，增加冠脈流量，提高小鼠耐缺氧能力，并可降低心肌酶活性，減輕異丙腎上腺素所致心肌缺血壞死。柴胡能增加心肌收縮力，減慢心率及降低血壓;藥理表明枳殼能增加冠脈血流，降低外周

17、阻力，抑制血栓形成和平滑肌收縮10;當歸具有抗血栓形成和抗血小板作用，抗心律失常及改善冠脈循環(huán)作用11;赤芍可以擴張冠脈，增加冠脈血流量，抑制炎癥反應12。有人總結，川芎嗪抗心肌缺血的循環(huán)機制為擴張冠脈，保護冠脈內皮，改善微循環(huán)等;其抗心肌缺血的非循環(huán)機制為降低心肌耗氧，抑制氧自由基作用，改善心肌細胞的代謝抑制狀態(tài)等13。 結果顯示，空白對照組VEGF，bFGF低水平表達，這屬正常情況，心肌細胞以此維持一定血管密度和通透性。在模型對照組，藥物對照組，活血通脈靈大、小劑量組中均有表達，且活血通脈靈大、小劑量組表達量高于前兩組，說明活血通脈靈能促進缺血心肌表達VEGF，bFGF，提示該藥有促血管生

18、成作用，這可能是該藥對于缺血心肌保護作用機制之一。 【參考文獻】  1 黃起壬，何 明，李 萍，等. 油茶皂苷抗心肌缺血大鼠氧自由基和脂質過氧化作用J. 中國藥理學通報，2003，19(9)：1034.    2 Scholz D, Cai WJ, Schaper W. Arteriogenesis, a new concept of vascular adaptation in occlusive diseaseJ. Angiogenesis, 2001, 4 (4): 247.3 Xu X H, Chen J G, Zhu J Z. Primary study of vascular endothelial growth factor immunohistochemical staining in the diagnosis of early acute myocardial ischemiaJ. Forensic Sci Int, 2001, 118 (1): 11.4 林 欣，江時森 .VEGF治療心肌梗塞后血管側支循環(huán)早期重建的可行性研究J .中國微循環(huán)，2001，5(2)：89.5 Lee CH, Smits PC. Vascular growth factors for coronary ang