嗜酸乳桿菌ATCC4356與變形鏈球菌UA159共生-第三軍醫(yī)大學學報

1、嗜酸乳桿菌 ATCC4356 與變形鏈球菌 UA159 共生現(xiàn)象研究王勤花1周智2*黃雅靜1 錢英子1 黃銳1(1.重慶醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院重慶400015； 2.重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 重慶 401147)【摘要】目的 為了探討乳酸桿菌與變形鏈球菌相互作用關(guān)系。方法 采用共培養(yǎng)的方法研究嗜酸乳桿菌 ATCC4356 與變形鏈球菌 UA159 及缺陷菌株在浮游狀態(tài)和生物膜中共生現(xiàn)象并檢測。結(jié)果 嗜酸乳桿菌 ATCC4356 能與主要致齲菌 UA159 及其缺陷菌株共生并產(chǎn)生共聚。結(jié)論 推測口腔微生態(tài)環(huán)境中，可利用乳酸桿菌與變形鏈球菌共聚結(jié)合形成沉淀的特性，清理變形鏈球菌降低患齲風險

2、，具有一定的防齲價值?！娟P(guān)鍵詞】嗜酸乳桿菌；變形鏈球菌；共聚；齲病Symbiosis oflactobacillus acidphilusATCC4356 with streptococcusmutans UA159WANG Qinhua1Zhou Zhi 2*Huang Yajing1Qian Yingzi1Huang Rui 1( 1.Dept. of Stomatology,ChongQing Medical Univer sity,Chongqi ng 40015,China;2. Dept. of Conservative Dentistr yand Endodontics,The

3、Affil iated Hospital of Stomatology,Chongqing Medical University,Chongqing 401147,China)Abstract Objective To investigate the interactions of lactobacillus acidophilus ATCC4356 wi th streptococcus mutans UA159 and its deletion mutants . M ethod Study symbiosis of this two bacterias in planktons and

4、biofilms by co-culture.Result It indicated that lactobacill us acidophilus ATCC4356 can coaggregate with streptococcus mutans UA159 and its deletion mutants.Conclusion It is reasonable to speculate that in oral microenvionment coaggregation of Lactobacillus with Streptococcus mutans may reduce carie

5、s risk by clearing streptococcus mutans basing on this result.We hope that it may apply useful informationsfor prevention of caries.1王勤花（ 1985-），女，碩士研究生，E-mail feixue20040514 ;周智（ 1971-），通訊作者，男，副教授，碩士生導師，從事齲病學研究，聯(lián)系電，E-mailzhouzhi_050918Key wordsl actobaci l lus acidophi l us , str epto

6、coccus mutans,symbi osis ,cari esCorrespondingauthor：Zhou Zhi,TelE-mail: zhouzhi_050918齲病不僅破壞牙體硬組織，還可引起牙髓病、根尖周病、頜骨炎癥等一系列病變影響咀嚼功能，進而嚴重影響身體健康1 。病原微生物是主要的致病因素，變形鏈球菌（變鏈菌， S.mutans）屬于口腔固有菌叢中的鏈球菌屬，具有廣泛的適應能力，長期持續(xù)存在于口腔中，也是現(xiàn)今公認的齲病主要致齲菌2 。早就有學者發(fā)現(xiàn)口腔內(nèi)不同種屬的細菌之間有相互凝集的現(xiàn)象3 ，比如變鏈菌、干酪乳桿菌、放線菌在唾液中有粘附凝集現(xiàn)象，

7、并通過實驗證實凝集素為鈣離子依賴性的蛋白質(zhì)4 ?？谇恢杏行┩僖喝闂U菌和發(fā)酵乳桿菌能與致齲鏈球菌發(fā)生共聚， 前者共聚不受乳糖的限制而后者共聚可被乳糖所抑制 5 。乳酸桿菌（乳桿菌）與變鏈菌共聚的影響因素還有 PH 值范圍、鈣離子濃度、蛋白酶抑制等等 6 。乳酸桿菌在益生乳制品中應用廣泛， 在調(diào)節(jié)胃腸道與泌尿生殖系統(tǒng)平衡方面發(fā)揮重要作用 7 。本文選取了一株常見乳酸菌 -嗜酸乳桿菌 ATCC4356(L .acidophilus ATCC4356)，研究其與主要致齲菌 -變鏈菌 UA159 在浮游狀態(tài)和生物膜結(jié)構(gòu)中共生時的現(xiàn)象和影響因素。1 材料與方法1.1材料1.1.1 菌株 :嗜酸乳桿菌 AT

8、CC4356 和變形鏈球菌 UA159( 后稱標準菌株 )購自四川大學華西口腔醫(yī)學院， 變形鏈球菌 LuxS 缺陷菌株及 comD 缺陷菌株由本課題組構(gòu)建8,9。1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 :MRS 培養(yǎng)基 10（g/L ）：胰蛋白胨 10.0，牛肉膏 10.0，酵母提取物 5.0，檸檬酸銨 2.0，葡萄糖 2.0，醋酸鈉 5.0，磷酸氫二鉀 2.0，硫酸鎂 0.58，硫酸錳 0.25，加入吐溫 -80 1.0 ml,水 1 L,調(diào) PH 6.2-6.6,用于嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)。TPY 培養(yǎng)基（ g/L ）：胰蛋白胨 15.0，酵母提取物 4.0，葡萄糖 10.0，蔗糖 10.0，磷酸二氫鉀 6.

9、0，磷酸氫二鉀 2.0，碳酸鈉 2.0，氯化鈉 2.0，加水 1 L 調(diào) PH 7.0（實驗室自配），用于變形鏈球菌的培養(yǎng)。腦心浸液培養(yǎng)基（ Brian Heart Infusion,BHI,Biomerieux Sa 公司，法國），用于乳桿菌和變鏈菌共培養(yǎng)。PBS 緩沖液， PH 7.0(實驗室自配 )。1.2 方法1.2.1 乳桿菌及變鏈菌的培養(yǎng) :乳桿菌 ATCC4356 加入 MRS 液體培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)箱 37培養(yǎng) 24h,3000 g 離心 10min 收集菌體， PBS 洗滌兩次，懸浮于 PBS 中用紫外光分光光度計調(diào) 600nm 吸光度值（ OD 值） 1.0。變鏈菌 UA15

10、9、LuxS 缺陷菌株和 comD 缺陷菌株分別加入 TPY 液體培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)箱 37培養(yǎng) 24 h，3000g 離心 10 min 收集菌體， PBS 洗滌兩次，懸浮于PBS 中調(diào) 600nmOD 值為 1.0。1.2.2 乳桿菌與變鏈菌 UA159、 LuxS 缺陷菌株和 comD 缺陷菌株浮游狀態(tài)中共聚現(xiàn)象觀察 11:：調(diào)乳桿菌 ATCC4356 與變鏈菌 UA159 的比例分別為 16/1、8/1、4/1、2/1、 1/1、 1/2、 1/4、 1/8、 1/16，組成總體積為 2mL 的混合溶液，震蕩 15sec 攝像觀察，室溫靜置培養(yǎng) 20min 攝像觀察。分別設(shè)置乳桿菌 AT

11、CC4356 與變鏈菌 UA159 為陰性對照。乳桿菌 ATCC4356 與變鏈菌的 LuxS 缺陷菌株、變鏈菌 comD 缺陷菌株操作方法同上述。1.2.3 乳桿菌與變鏈菌UA159、 LuxS 缺陷菌株和 comD 缺陷菌株共培養(yǎng)形成生物膜觀察 : 將上述調(diào)整好濃度的乳桿菌和變鏈菌各取 1ml 菌液加入含有 10mlBHI 液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每一組三個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿中放入 3 塊 1cm×1cm 的滅菌蓋玻片，恒溫 37靜置培養(yǎng) 24h12 。用 PBS 洗去表面浮游細菌，戊二醛固定，梯度酒精脫水后送檢掃描電鏡檢測 13 。2 結(jié)果2.1 乳桿菌與變鏈菌標準菌株、LuxS

12、 缺陷菌株和 comD 缺陷菌株共聚現(xiàn)象乳桿菌 ATCC4356 與變鏈菌 UA159 混合后震蕩 15sec見混合溶液均勻未見沉淀形成，靜置 20min 后部分比例（ 1/1、1/2、 1/4、 1/8）的混合溶液見絮狀沉淀形成，說明 ATCC4356 可與 UA159 發(fā)生共聚。乳桿菌與變鏈菌 LuxS 缺陷菌株混合后震蕩 15sec也未見沉淀形成，靜置 20min 比例（ 1/2、1/4、1/8）發(fā)生共聚。乳桿菌 ATCC4356 與變鏈菌 comD 缺陷菌株比例（ 2/1、1/1、1/2）發(fā)生共聚（圖 1），選取乳桿菌與變鏈菌 1/1 發(fā)生共聚的菌體在光學顯微鏡下觀察， 可見短鏈狀的變

13、鏈菌與短桿狀的乳桿菌共聚結(jié)合成團塊（圖 2）。用統(tǒng)計學方法分析， 比較乳桿菌與變鏈菌標準菌株缺陷菌株，共聚現(xiàn)象沒有差異（ p>0.05）。(a)(b)(c)(d)(e)(f)圖 1乳桿菌 ATCC4356 與變鏈菌UA159 、 LuxS 缺陷菌株和comD 缺陷菌株共聚現(xiàn)象Fig.1Coaggregation of L.acidophilusATCC4356 withS.mutans UA159 、 LuxS deletionmutant、 comD deletion mutant注： 16/1 的比例在實驗中均未有絮狀沉淀出現(xiàn)，未展示出來（ a）震蕩 15sec 攝像，第一管為乳桿菌

14、ATCC4356空白對照， 后面依次為比例8/1 ，4/1 ，2/1 ，1/1 ， 1/2 ， 1/4 ，1/8 ， 1/16(ATCC4356 與 UA159 體積比 ) ，最后一管為變形鏈球菌UA159 空白對照；（ b） 20min 后 , 比例 1/1 ， 1/2 ， 1/4 ， 1/8 中出現(xiàn)絮狀沉淀；（c）乳桿菌ATCC4356與變鏈菌 LuxS 缺陷菌株震蕩15sec 后立即攝像；（ d）乳桿菌ATCC4356與變鏈菌 LuxS 缺陷菌株 20min 后攝像，在比例1/2 ， 1/4 ， 1/8中出現(xiàn)絮狀沉淀；（e）乳桿菌 ATCC4356與變鏈菌comD缺陷菌株震蕩 15sec

15、后立即攝像；（f ）乳桿菌 ATCC4356與變鏈菌 comD缺陷菌株 2/1 ，1/1 ， 1/2 比例發(fā)生共聚Note: The ratio 16/1 was delated for no flocculation in various experiments（ a） It is vortexed for 15 sec and photographedimmediately,thefirst contained onlyL. acidophilus ATCC4356 and next 8/1, 4/1, 2/1, 1/1, 1/2, 1/4, 1/8,1/16(L .acidophilus

16、ATCC4356/ S.mutans UA159),the last containedS.mutans UA159 pure cultures; (b) Itis photographed after 20 min.,flocculation was observed in ratio 1/1,1/2,1/4,1/8;(c) photograph ofL. acidophilusATCC4356 andS. mutans LuxS deletion mutant aftervortexing 15 sec;(d)photographofL.acidophilusATCC4356and .Lu

17、xS deletionS mutansmutant after 20 min, flocculation was observed in ratio 1/2,1/4,1/8;(e) photographof L. acidophilusATCC4356and S. mutans comD deletionmutant aftervortexing15 sec;(f) L . acidophilus ATCC4356 and S.mutans comD deletion mutant coaggregated in ratio 2/1,1/1,1/2.(a)(b)(c)圖2乳桿菌 ATCC435

18、6 與變鏈菌UA159 、 LuxS缺陷菌株和comD 缺陷菌株共聚現(xiàn)象顯微鏡下觀 ( ×100)Fig.2Coaggregation of L.acidophilusATCC4356 withS.mutans UA159 、 LuxS deletion mutantand comD deletion mutant under microscope(100)×(a)乳桿菌ATCC4356與變鏈菌UA159；(b) 乳桿菌 ATCC4356 與變鏈菌LuxS 缺陷菌株； (c) 乳桿菌 ATCC4356 與變鏈菌comD 缺陷菌株(a)L.acidophilusATCC435

19、6and S.mutans UA159;(b) L .acidophilusATCC4356and S.mutansLuxS deletion mutant;(c) L.acidophilus ATCC4356 and S.mutans comD deletion mutant2.2 乳桿菌與變鏈菌生物膜形成檢測乳桿菌分別與變鏈菌標準菌株、缺陷菌株混合培養(yǎng)24h，掃描電鏡檢測生物膜結(jié)構(gòu)形態(tài)。培養(yǎng)生物膜中乳桿菌與變鏈菌標準菌株結(jié)合緊密，可見大量菌體混雜。乳桿菌與 LuxS、comD缺陷菌株形成的生物膜相對疏松，胞外基質(zhì)包裹變鏈菌和乳桿菌形成團塊（圖3）。(a)(b)(c)圖 3 乳桿菌與變鏈菌2

20、4h 生物膜掃描電鏡檢測( ×20000)Fig.3Scanning electron micrographs of L .acidophilus and S.mutans biofilms after 24hincubation(20000)×(a)乳桿菌 ATCC4356 與變鏈菌 UA159 ；(b) 乳桿菌 ATCC4356 與變鏈菌 LuxS 缺陷菌株； (c) 乳桿菌 ATCC4356 與變鏈菌 comD 缺陷菌株(a)L.acidophilusATCC4356and S.mutans UA159;(b) L .acidophilusATCC4356and S.

21、mutansLuxS deletion mutant;(c) L.acidophilus ATCC4356 and S.mutans comD deletion mutant3 討論人類對齲病的研究經(jīng)歷了相當長的時間, 其病因?qū)W一直是研究者關(guān)注的重點，也明確了變鏈菌在其中的主導作用。變形鏈球菌致齲毒力因子和致齲機制研究已取得了一定進展 14 ，而乳桿菌在齲病中的作用一直存在爭議，有人認為乳桿菌促進了齲病的發(fā)生發(fā)展15,16,17,，但也有報道乳桿菌發(fā)酵的乳制品對變形鏈球菌有抑菌作用 18，表明乳桿菌的代謝產(chǎn)物對致齲菌變形鏈球菌有著明顯的拮抗作用19 。為了研究乳桿菌與變鏈菌相互作用關(guān)系，本文選

22、取了嗜酸乳桿菌ATCC4356和變鏈菌 UA159 及其缺陷菌株，體外研究二者在浮游狀態(tài)和生物膜中相互作用影響。前人研究表明共聚受諸多因素影響，本項研究主要探討同一pH 值（ PH7.0），不同濃度及混合細菌的比例對共聚的影響。發(fā)現(xiàn)乳桿菌和變鏈菌濃度較低時，如600nm OD 為 0.1，震蕩 15 秒及靜置 20 分鐘后均無絮狀沉淀產(chǎn)生，認為未共聚。而調(diào)整乳桿菌和變鏈菌濃度至600nm OD 1.0 時，部分比例的混合菌液中有絮狀沉淀產(chǎn)生，乳桿菌與變鏈菌純培養(yǎng)液仍均勻未見沉淀產(chǎn)生，判定乳桿菌可與變鏈菌發(fā)生共聚。認為細菌濃度也是影響共聚的因素之一，而乳桿菌ATCC4356 與變鏈菌標準菌株和缺

23、陷菌株均共聚效率沒有差異。形態(tài)多樣、結(jié)構(gòu)復雜的菌斑生物膜 20是細菌生長代謝和信息交流的場所，其生物學特性與浮游狀態(tài)細菌有明顯差異。變鏈菌是牙菌斑生物膜中重要成分，通過密度信號感應系統(tǒng)調(diào)控自身行為適應環(huán)境，其中 comCDE 雙組份系統(tǒng)控制細菌種屬內(nèi)信息交流，而 LuxS 基因介導控制細菌種屬間信息交流 20 。故要進一步研究在生物膜結(jié)構(gòu)中乳桿菌與變鏈菌相互作用影響。生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)上的差異是由標準菌株和缺陷菌株生物膜形成能力的差異造成，結(jié)果表明乳桿菌與變鏈菌標準菌株、缺陷菌株在生物膜中均可共生結(jié)合成團塊， comCDE 雙組份系統(tǒng)和 LuxS 信號系統(tǒng)對共聚未產(chǎn)生明顯影響。據(jù)此推測在口腔微生態(tài)

24、環(huán)境中，也許可以利用乳桿菌與變鏈菌共聚結(jié)合特性，通過吞咽動作清理變鏈菌降低患齲風險，具有防齲價值，但因為生物膜結(jié)構(gòu)的復雜性和本實驗中標準菌株和缺陷菌株表現(xiàn)出的差異性，進一步深入研究將具有十分重要的意義。作者簡介王勤花（ 1985- ），女，碩士研究生，E-mailfeixue20040514 ，聯(lián)系電參考文獻1 樊明文 ,周學東 .牙體牙髓病學 M. 第 2 版. 北京 :人民衛(wèi)生出版 2006:3-4.2 Fitzgerald RJ, Keyes PH. Demonstration of the etiologic role of streptococci in e

25、xperimentalcaries in the hamsterJ. J Am Dent Assoc,1960,61:9-19.3Clemans DL,Kolenbrander PE,Debabov DV,et al.Insertional Inactivation of Genes Responsiblefor the D-Alanylation of Lipoteichoic Acid in Streptococcus gordoniiDL1 (Challis)J.InfectImmun,1999,67(5):2464 2474.4 Rundegren J. Calcium-depende

26、nt salivary agglutinin with reactivity to various oral bacterialspeciesJ. Infection and Immunity ,1986, 53(1):173-178.5Willcox MD,Patrikakis M,Harty DW,et al .Coaggregation of oral lactobacilli with streptococcifrom the oral cavityJ. Oral Microbiol Immunol,1993,8(5):319-321.6 許榮譽,莊建良,張海云.12 株乳桿菌益生特性

27、的研究J.醫(yī)學研究生報,2008,21（12） :1247-12487 Lang C, B?ttner M, Holz C, et al . Specific Lactobacillus/Mutans Streptococcusco-aggregationJ. J Denl Res, 2010,89(2) :175-179.8李月恒 ,陳慧珍，周智，等.替代失活法構(gòu)建變形鏈球菌LuxS 缺陷菌株 J. 中國微生態(tài)學雜志， 2011,23（ 3） .9陳嬌 ,周智 ,尹一兵等 .電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建變形鏈球菌UA159 comD 缺陷菌株 J. 中國微生態(tài)學雜志， 2011,23（ 4） .10金樁 ,彭健，胡新文， 等.嗜酸乳桿菌 1.557 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分優(yōu)化研究J.飼料工業(yè)，2010,31（ 2）.11 Yi Liu,Lina Wang,Xuedong Zhou ， et al . Effect of the antimicrobial decapeptide KSL on the