腎母細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤模型的建立及其生物學(xué)特性-

1、本課題為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目作者單位:200032上海醫(yī)科大學(xué)兒科醫(yī)院外科(畢允力、高解春;上海腫瘤研究所(姚明實(shí)驗(yàn)研究腎母細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤模型的建立及其生物學(xué)特性畢允力高解春姚明【摘要】目的采取手術(shù)標(biāo)本,在裸鼠皮下連續(xù)傳代建立人腎母細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤模型。方法切取腎母細(xì)胞瘤患兒腫瘤組織植入裸小鼠右前肢皮下,連續(xù)傳代。觀測腫瘤生長,對(duì)各代移植瘤進(jìn)行光鏡和電鏡觀察,波形蛋白(vimentin及上皮膜抗原(EMA免疫組化染色,WT1基因檢測。結(jié)果10個(gè)月中連續(xù)在裸鼠皮下傳4代,總成瘤率為43%。移植瘤生長曲線與G ompentz函數(shù)符合。移植瘤保留了原腎母細(xì)胞瘤的組織學(xué)特征。Vimentin在各

2、代腫瘤細(xì)胞中均可見表達(dá)。而EMA在本腫瘤中均無陽性表現(xiàn)。圖像分析結(jié)果提示各代移植瘤DNA指數(shù)及其細(xì)胞時(shí)相分布基本一致。WT1基因3段短重復(fù)序列長度在各代之間無變化。結(jié)論該模型基本保留了原腫瘤的生物學(xué)特性,是腎母細(xì)胞瘤基礎(chǔ)及臨床研究的良好模型?！娟P(guān)鍵詞】腎母細(xì)胞瘤;疾病模型,動(dòng)物;腫瘤移植;生物學(xué)Nude mice Wilmstumor modelB I Y unli,GA O Jiechun,YA O Ming.S hanghai Children Hospital, S hanghai Medical U niversity,S hanghai200032,China.【Abstract】O

3、bjectiveTo establish Wilmstumor model in nude mice by hypodermic inoculation of human Wilmstumor specimens.MethodsFresh human Wilmstumour s pecimens were sliced and inocu2 lated hypodermically into the forelimbs of nude mice.The tumor proliferation was monitored.Tumor sam2 ples were subjected to lig

4、ht and electronic microscopy examination and were immunostained for Vimentin and EMA.WT1gene expression was evaluated with PCR.R esultsDuring the10months period of study, 4generations of tumor divisions were recorded.The growth curve corresponded to the G ompentz function. The transplanted tumor cel

5、ls retained the original histological tumor character.Immuno-staining of Vi2 mentin was positive in each generation of tumor cells whereas that of EMA was negative.DNA index and cell cycle distribution were similar in each generation.The3end of WT1gene sequence remained intact in each generation.Con

6、clusionThe nude mice Wilmstumor model retains all the biological characteristics of the tumor and is suitable for Wilmstumor study.【K ey w ord】Nephroblastoma;Disease models,animal;Neoplasm transplantation;Biology腎母細(xì)胞瘤是小兒最常見的惡性腫瘤之一,其生物學(xué)特性和治療實(shí)驗(yàn)一直是眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。人惡性腫瘤的裸小鼠異種移植瘤模型是研究腫瘤形態(tài)、病理、生化代謝、染色體核型、細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及特

7、殊功能的重要方法1,但腎母細(xì)胞瘤裸鼠移植相對(duì)困難,文獻(xiàn)報(bào)道較少,國內(nèi)至今尚未建立該腫瘤的裸鼠移植模型。筆者首次在國內(nèi)建立了人腎母細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤模型,并通過形態(tài)觀察、免疫組化、基因檢測對(duì)其生物特性進(jìn)行觀察,報(bào)道如下。材料與方法1.人體腫瘤標(biāo)本來源腫瘤組織來源于1例5歲女性腎母細(xì)胞瘤患兒。術(shù)中見腫瘤破潰,腸系膜淋巴結(jié)腫大,腎靜脈內(nèi)有瘤栓形成。病理學(xué)診斷為低分化間變型腎母細(xì)胞瘤,鏡檢見大量圓形及梭形的幼稚細(xì)胞,其基質(zhì)呈粘液樣?？梢姼鞣N不同分化程度的上皮成分,排列成巢索狀,幼稚細(xì)胞密集,伴有片狀出血壞死。2.腫瘤移植與傳代在無菌條件下切取患兒腫瘤組織在超凈工作臺(tái)上,將腫瘤組織切成2mm3小塊,生理鹽

8、水沖洗,用套管針植入BALB/C(n/ n雄性裸小鼠右前肢皮下,接種工作在標(biāo)本離體后30min內(nèi)完成。鼠齡6周,體重1820g。定期觀察移植部位,待腫瘤長至直徑12cm時(shí),脊椎脫臼法處死裸鼠,用同樣方法進(jìn)行下一輪接種,每代6 40只不等,連續(xù)傳代。因預(yù)實(shí)驗(yàn)及進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)需要,每代裸鼠數(shù)量不等。3.腫瘤生長測量定期觀察腫瘤生長情況,記錄腫瘤生長的潛伏期和腫瘤生長速度,當(dāng)腫瘤直徑達(dá)3mm時(shí),定人每隔1周應(yīng)用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大直徑a及橫徑b,按公式V=/6×a×b2計(jì)算腫瘤體積。用指數(shù)函數(shù)先計(jì)算其生長速率K= (InV t-InV0/t,再計(jì)算其生長曲線及倍增時(shí)間Td =In2

9、/K。4.病理組織學(xué)觀察處死及自然死亡的實(shí)驗(yàn)鼠,解剖并切取腫瘤以觀察腫瘤鏡下結(jié)構(gòu)及浸潤、各臟器轉(zhuǎn)移情況,標(biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為10%福爾馬林固定,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察。5.電子顯微鏡觀察腫瘤組織樣品用體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定,7%蔗糖磷酸緩沖液沖洗再固定于體積分?jǐn)?shù)為1%OsO4(鋨酸中,丙酮逐級(jí)脫水,環(huán)氧樹脂812號(hào)包埋,超薄切片,枸櫞酸鉛、醋酸鈾雙重染色,J EM1200透射電鏡觀察。6.免疫組化標(biāo)記采用ABC法進(jìn)行波形蛋白(vimentin和上皮膜抗原(EMA免疫組織化學(xué)定位,由腫瘤醫(yī)院免疫病理室協(xié)助完成。一抗?jié)舛? vimentin1500(DA KO公司,EMA1

10、500(DA KO 公司。7.圖像分析儀檢測DNA含量腫瘤標(biāo)本用體積分?jǐn)?shù)為10%福爾馬林固定,石蠟包埋,23m切片,HE和Agure染色。采用圖像分析儀測定50 100個(gè)細(xì)胞核,以同張切片間質(zhì)淋巴細(xì)胞核DNA含量均數(shù)作二倍體對(duì)照,直方圖形式打印輸出DNA 指數(shù)(DI和A區(qū)域(G0和G1時(shí)相細(xì)胞,B區(qū)域(S 時(shí)相細(xì)胞和C區(qū)域(G2和M時(shí)相細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。8.聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測WT1基因取100mg 腫瘤組織,酚、氯仿腫瘤組織基因組DNA的抽提。以5AA TG A G ACTTACTGGGTG A GG3,5TTA2 CACA GTAA TTTCAA GCAACGG3擴(kuò)增WT1基因3端短重復(fù)序列,PC

11、R條件:于95100水浴中預(yù)變性1015min;變性:909545s;退火:55 5845s;延伸:707245s,共35個(gè)周期,最后延伸10min,(均為Promega公司產(chǎn)品,操作步驟遵其產(chǎn)品說明。紫外光檢測擴(kuò)增條帶。結(jié)果1.裸鼠及移植瘤的生長特點(diǎn)10個(gè)月中連續(xù)裸鼠皮下傳4代,共移植裸鼠76只,移植1周內(nèi)局部腫塊逐漸消退,7周后肉眼見腫瘤逐漸增大。鼠間傳代潛伏期為50d左右,第1代移植瘤6個(gè),成瘤率100%(6/6,第2代21個(gè),成瘤率42.9%(9/21,第3代9個(gè),成瘤率44.4%(4/9,第4代40個(gè),成瘤率40%(15/40,總成瘤率為43%。第2代長期飼養(yǎng)的4只荷瘤鼠平均生存中位

12、數(shù)為223d,最長荷瘤時(shí)間為261d。2.移植瘤組織動(dòng)力學(xué)第2代4只荷瘤鼠連續(xù)觀察12周,繪制生長曲線。曲線經(jīng)潛伏期進(jìn)入快速生長期后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期。曲線與G ompentz函數(shù)符合。第2代荷瘤鼠腫瘤倍增時(shí)間見表1,隨接種時(shí)間增加,倍增時(shí)間似有迅速增加趨勢(shì)。表1第2代荷瘤鼠體積及倍增時(shí)間接種周數(shù)腫瘤體積(mm3倍增時(shí)間(d8135 5.309337 5.7510781 5.6811183521.9512228340.2513257243.9114286443.9115320160.3816348996.6017365069.00183908161.001940213.移植瘤的組織病理學(xué)顯微鏡下觀

13、察各代移植瘤細(xì)胞生長活躍,各代之間細(xì)胞形態(tài)一致,間質(zhì)細(xì)胞少見,細(xì)胞呈小圓形,核漿比例大,核染色深。保留了原腎母細(xì)胞瘤的組織學(xué)特征。鏡檢可見移植瘤周圍結(jié)締組織邊界清楚,未見明顯癌組織侵入周圍組織。心、肺、肝等重要臟器病理未見腫瘤轉(zhuǎn)移灶。4.透射電鏡檢查電鏡下可見,腫瘤細(xì)胞極其豐富,細(xì)胞核密集、核大、不規(guī)則、核仁多、貼邊、包漿少,可見核糖體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。所檢測的第2、第4代移植瘤均有上述表現(xiàn)。5.免疫組化Vimentin在各代腫瘤細(xì)胞中均可見表達(dá)。而EMA這一上皮性標(biāo)記在本腫瘤中均無陽性表現(xiàn)。與原腫瘤免疫組化結(jié)果一致。6.DNA圖像分析圖像分析結(jié)果(表2提示各代移植瘤DNA指數(shù)及其細(xì)胞時(shí)相分布基本

14、一致,保持惡性腫瘤細(xì)胞的生長特征。7.WT1檢測原腫瘤與各代移植瘤WT1基因均無缺失,所檢測的3端短重復(fù)序列長度在各代之間無變化(圖1。 表2各代移植瘤DNA 指數(shù)與細(xì)胞時(shí)相分布分組DNA 指數(shù)細(xì)胞時(shí)相分布G0+G1S G2+M 原代1.8175.6824.32 14為各代腫瘤標(biāo)本;5為患兒腫瘤標(biāo)本;6為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物圖1各代腫瘤WT1電泳條帶圖討論裸鼠移植瘤模型的出現(xiàn)大大提高了腫瘤異體移植成功率,簡化了移植瘤制作過程。與體外細(xì)胞培養(yǎng)相比,移植瘤模型的建立和長期傳代相對(duì)方便,不受成纖維細(xì)胞污染;更重要的是它保留了實(shí)體腫瘤生長的特點(diǎn),如腫瘤的增生受宿主的營養(yǎng)情況和血供的影響;而且能夠同時(shí)觀察腫瘤和宿

15、主的相互影響。目前裸鼠移植瘤模型已成為化療藥物篩選的主要工具2。更有大量的文獻(xiàn)報(bào)道了移植瘤在腫瘤病理形態(tài)、生化指標(biāo)、腫瘤生長、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面的研究應(yīng)用。建立人腫瘤裸鼠模型必須具備3點(diǎn)3:移植瘤能在動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)增殖和長期傳代,移植瘤的形態(tài)和功能與原人體腫瘤保持一致,從遺傳學(xué)角度證明移植瘤來源于人體而非受體動(dòng)物。研究發(fā)現(xiàn),第1代移植瘤可建立長期傳代模型的概率約為1/3,而第3代的可能性增加到90%。移植瘤在免疫缺陷的宿主中可能誘發(fā)自發(fā)瘤,但其發(fā)生率極低,僅約1.7%,多見的是淋巴網(wǎng)織系統(tǒng)腫瘤和肺腺癌4。可通過組織病理和各種生物特性觀察予以確定。研究發(fā)現(xiàn),不同腫瘤移植接種成功率不同,腎母細(xì)胞瘤接種成

16、功率為33%左右2。接種成功率決定于每個(gè)腫瘤自身的特性、腫瘤的類型、來源(原發(fā)腫瘤、復(fù)發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤、標(biāo)本處理方法、組織分化,以及裸鼠的周齡、營養(yǎng)狀況、感染情況、接種部位都將影響接種結(jié)果。裸鼠前胸外側(cè)壁較后側(cè)肢體成功率高。裸鼠雖無T 淋巴細(xì)胞,但仍有免疫球蛋白、自然殺傷細(xì)胞、吞噬細(xì)胞,隨裸鼠成熟或在感染情況下,這類免疫功能將成熟或被激活,使接種成功率降低。有報(bào)道用免疫抑制劑Carragheenan 抑制吞噬細(xì)胞功能或使用3周內(nèi)的幼鼠可增加接種成功率。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤的惡性程度與接種成功率有關(guān),預(yù)后差的腫瘤、復(fù)發(fā)腫瘤及尸檢標(biāo)本接種成功率高,腫瘤病理分化程度差接種成功率高。本課題接種的標(biāo)本正是1例

17、低分化間變型腎母細(xì)胞瘤,腫瘤為4期,臨床見腫瘤已侵及腎靜脈,預(yù)后較差。我們建立的腫瘤模型現(xiàn)已穩(wěn)定傳至第4代,平均成瘤率超過40%,第1代達(dá)100%,以后各代穩(wěn)定在40%。本模型荷瘤鼠的潛伏期及倍增時(shí)間在各代之間表現(xiàn)較均一,潛伏期在4560d 左右,平均50d 。移植腫瘤在裸鼠體內(nèi)一般要經(jīng)過潛伏期后才開始生長,接種早期腫瘤細(xì)胞大部分壞死吸收,以后隨腫瘤血管生成,受體的基質(zhì)及血管長入,殘留的腫瘤細(xì)胞增生,出現(xiàn)可見的腫塊。這一時(shí)期一般為2周至3個(gè)月,不同腫瘤的移植瘤潛伏期并不一致,潛伏期可隨傳代過程而有所縮短,但腫瘤的生長特點(diǎn)卻在個(gè)代之間保持穩(wěn)定。研究未發(fā)現(xiàn)腫瘤的惡性程度與潛伏期的關(guān)系。腫瘤的細(xì)胞動(dòng)

18、力學(xué)研究由來已久,早在1956年Collins 5在研究肺轉(zhuǎn)移癌時(shí)提出了腫瘤的指數(shù)增長模型,1964年Laird 6進(jìn)一步指出腫瘤的生長符合G ompertz 函數(shù)。腫瘤生長早期階段接近指數(shù)形式,以后隨代謝產(chǎn)物堆積、營養(yǎng)障礙、細(xì)胞死亡及有絲分裂周期延長生長速度逐漸減慢,最后接近平臺(tái)期。本實(shí)驗(yàn)移植瘤符合這一生長規(guī)律。第2代長期飼養(yǎng)的荷瘤鼠平均生存中位數(shù)為223d ,最長荷瘤時(shí)間261d ,腫瘤未發(fā)現(xiàn)重要臟器轉(zhuǎn)移,鏡檢可見腫瘤包膜。裸鼠主要死于腫瘤消耗和衰竭。本實(shí)驗(yàn)病理檢查示各代轉(zhuǎn)移瘤與原人體腫瘤之間鏡下結(jié)構(gòu)相同。典型的腎母細(xì)胞瘤鏡檢可見小球樣結(jié)構(gòu),本例腫瘤分化程度低,以胚基細(xì)胞為主,光鏡表現(xiàn)不典

19、型。電鏡檢查發(fā)現(xiàn)該腫瘤主要由未分化細(xì)胞組成,細(xì)胞核密集、核大、不規(guī)則、核仁多、貼邊、包漿少。Vimentin 檢測在各代細(xì)胞中均有明顯表達(dá),腎母細(xì)胞瘤移植模型中基質(zhì)細(xì)胞Vimentin 可呈弱陽性7。圖像分析儀DNA 檢測結(jié)果示,腫瘤細(xì)胞主要為高倍體,在高二倍體到高四倍體之間,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為移植瘤DNA 指數(shù)較為穩(wěn)定,近年來有腫瘤移植后DNA 指數(shù)改變的報(bào)道,K opf 2Maier 等8應(yīng)用流式細(xì)胞儀研究發(fā)現(xiàn)移植瘤在接種早期細(xì)胞分裂相少見,進(jìn)入指數(shù)增長期后分裂相細(xì)胞數(shù)量增加,當(dāng)腫瘤超過10cm 進(jìn)入平臺(tái)期時(shí)分裂相細(xì)胞再次減少,接種后腫瘤細(xì)胞染色質(zhì)數(shù)量均有上述變化過程。腎母細(xì)胞瘤分子生物學(xué)研究主

20、要集中于WT1基因異常與腎母細(xì)胞瘤的關(guān)系。80年代LOH 研究發(fā)現(xiàn)11p13位點(diǎn)可能存在抑癌基因,據(jù)此1990年克隆到了WT1基因,研究發(fā)現(xiàn)30%的無虹膜綜合征、S 2B 綜合征的腎母細(xì)胞瘤患者和10%的散發(fā)患者存在這一抑癌基因的缺失或突變。故該基因被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系9。在裸鼠傳代過程中,可發(fā)生染色體丟失造成所在部位的基因缺損,改變腫瘤細(xì)胞表型。筆者運(yùn)用PCR 方法檢測3端短重復(fù)序列發(fā)現(xiàn)其在各代之中均存在,說明該腫瘤無WT1基因所在部位的染色體丟失。但仍不能排除WT1基因存在點(diǎn)突變或外源序列插入的可能,可進(jìn)一步運(yùn)用PCR 2SSCP 或DNA 測序方法明確。人腫瘤異體移植裸小鼠模型

21、可模擬人癌體內(nèi)的自然生長過程,已廣泛應(yīng)用于人類腫瘤的基礎(chǔ)理論和臨床治療的實(shí)驗(yàn)。筆者建立的這一腎母細(xì)胞瘤異體移植瘤模型可用于腎母細(xì)胞瘤化療、基因治療、藥物誘導(dǎo)治療等各方面,為該腫瘤的進(jìn)一步深入研究提供了一個(gè)較為理想的模型。參考文獻(xiàn)1Sharkey FE ,Fogh J.Considerations in the use of nude mice for can 2cer research.Cancer and Metastasis Reviews ,1984,3:3412360.2Mattern J ,Bak M ,Hahn EW ,et al.Human tumor xenografts as

22、model for drug testing.Cancer and Metastasis Reviews ,1987,7:2632284.3孫惠,戰(zhàn)忠利,董建蕓,等.人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的建立及其生物特性的實(shí)驗(yàn)研究.實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤,1994,21:7862791.4Dunn TB.Normal and pathologic anatomy of the reticular tissue inlaboratory mice with a classification and disscussion of neoplasms.J NCI ,1954,14:128121390.5Collins VP.T

23、ime of occurrence of pulmonary metastasis from carci 2noma of colon and rectum.Cancer ,1962,15:3852387.6Laird A K.Dynamics of tumor growth.Growth ,1964,28:49125207Altmannsberger M ,Osborn M ,et al.Distinction of nephroblastomasfrom other childhood tumors using antibodies to intermediate fila 2ments.

24、Cell Pathology ,1984,45:1132124.8K opf 2Mair P ,Jackel M.Proliferation behavior of xenografted humantumors :a flow cytometric study.Anticancer Research ,1988,8:135521360.9Grundy P ,Coppes MJ ,Haber D.Molecular genetics of Wilm s tu 2mor.Hematology Oncology Clincs of North America ,1995,9:120121215.(收稿日期:1999202225(本文編輯:余文兵病例報(bào)告作者單位:525200廣東省高州市人民醫(yī)院普外科腹腔鏡下巨結(jié)腸根治術(shù)1例梁偉成鄧建中薛峰梁日光患兒:男,10個(gè)月。因腹脹、排大便困