結(jié)締組織生長(zhǎng)因子特異性結(jié)合肽的表達(dá)及分離純化 醫(yī)學(xué)論文

1、    結(jié)締組織生長(zhǎng)因子特異性結(jié)合肽的表達(dá)及分離純化 醫(yī)學(xué)論文              本文由中國(guó)論文范文收集整理。 【摘要】   目的：利用基因工程技術(shù)獲得與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）特異性結(jié)合的小肽。 方法 ：設(shè)計(jì)并合成帶有腸激酶切割位點(diǎn)的基因片段，插入pET?32(a)+質(zhì)粒載體中硫氧化還原蛋白基因下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coli BL21表達(dá)菌中，用終濃度1mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白；

2、用熱變性和硫酸銨分級(jí)沉淀對(duì)融合蛋白進(jìn)行初步純化，然后用親和層析進(jìn)一步純化，經(jīng)腸激酶切割，最后用凝膠過濾層析分離獲得目的小肽；用反相色譜對(duì)所獲小肽進(jìn)行純度鑒定。結(jié)果：所構(gòu)建的重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致；誘導(dǎo)表達(dá)后用SDS?PAGE鑒定，發(fā)現(xiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量20 000處有濃密的表達(dá)條帶出現(xiàn)，與預(yù)期一致；融合蛋白用熱變性和硫酸銨分級(jí)沉淀進(jìn)行初步純化，得率分別為78.6和52.3；用親和層析純化得率為50.5；經(jīng)腸激酶切割后用凝膠過濾層析分離獲得目的小肽，用反相色譜鑒定其純度大于95%；最終每升發(fā)酵液獲得3.4mg目的肽。結(jié)論：成功制備CTGF特異性結(jié)合肽，為進(jìn)一步 研究 該小肽的生物學(xué)活性打下基礎(chǔ)。

3、 【關(guān)鍵詞】   結(jié)締組織生長(zhǎng)因子 分離純化 特異性肽    結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)是Bradham等于1991年首次在人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，由349個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成；主要由皮膚成纖維細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等合成分泌。CTGF可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、合成膠原，介導(dǎo)細(xì)胞黏附，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管形成，刺激成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育以及傷口愈合，在多種器官和組織纖維化的發(fā)生、 發(fā)展 過程中起重要作用。本研究在先前我

4、們用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)CTGF特異性結(jié)合肽的基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)制備該小肽，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性，開發(fā)成CTGF小分子抑制劑打下基礎(chǔ)。    1  材料和方法     1.1  材料    BL21（DE3）、JM109，本實(shí)驗(yàn)室保存； pET?32(a)+質(zhì)粒、腸激酶試劑盒，Novagen公司；His?SelectTM，Sigma公司；Sephadex?G25, Phamarcia公司；限制性內(nèi)切酶BamH、Xho、EcoR，T4 DNA連接酶，Promega公司；膠回收試劑

5、盒，上海生工生物工程技術(shù)有限公司；電泳儀，北京六一儀器廠；水平搖床，太倉(cāng)市光明實(shí)驗(yàn) 分析 儀器廠。    1.2  方法    根據(jù)我們先前從隨機(jī)12肽庫(kù)中篩選得到的噬菌體陽(yáng)性克隆DNA測(cè)序結(jié)果，合成一對(duì)帶有腸激酶位點(diǎn)、編碼目的基因（810A）的相互配對(duì)的引物Pa1和Pa2，用ddH2O配成50pmol·l-1的引物溶液。PCR反應(yīng)體系如下：dNTP（10mmol·L-1）0.5l，10×buffer 2.5l， Pa1和Pa2各1l，Taq酶（10U·l-1）0.2l，最后ddH2O

6、補(bǔ)齊至25l；PCR反應(yīng)條件：94預(yù)變性5min；94 變性30s，60 退火30s，72延伸 30s，30個(gè)循環(huán)；72延伸7min，4保溫。PCR產(chǎn)物用20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，EB染色5min，紫外燈下觀察并切下目的條帶，用凝膠回收試劑盒純化目的片段。    將含pET?32(a)+質(zhì)粒的大腸桿菌接種于含氨芐青霉素 (終濃度100g·ml-1 )的 MH?Amp平板上，37培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)菌落，接種于含相同質(zhì)量終濃度氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37振搖至A600 nm為0.6，提取pET?32(a)+質(zhì)粒DNA，12g&#

7、183;L-1瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。用限制性內(nèi)切酶BamH及Xho，37酶切pET?32(a)+質(zhì)粒DNA和PCR產(chǎn)物2h，65 20min滅活。12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，EB染色，紫外燈下觀察并切下目的條帶，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行凝膠回收。在EP管中依次加入回收的質(zhì)粒DNA10l，目的基因片段1l，10×連接緩沖液1l，T4DNA連接酶1l，4連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，冰上孵育30min，42熱激90s，加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)液1ml，37水浴30min，離心將沉淀涂布于含氨芐青霉素(終濃度100g·ml-1) MH?Amp平板上

8、，37培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選單菌落接種于含氨芐青霉素(終濃度100 g·ml-1)的LB液體培養(yǎng)液，37震搖6h，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶BamH、Xho和EcoR酶切，12g·L-1瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為T7終止子引物。    取重組質(zhì)粒DNA 5l轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37孵育過夜，挑單菌落擴(kuò)增后以1%的接種量轉(zhuǎn)接250ml培養(yǎng)基，37振搖至A600 nm為0.60.8，加終濃度為1mmol·L-1的IPTG，37誘導(dǎo)8h。離心收集菌體，在菌體中加入12ml含50mmol·L-1Tris?HCl、1mmol·L-1 EDTA、1mmol·L-1 PMSF、320l 10g·ml-1溶菌酶的混合液，均勻攪拌30min，15000r·min-14離心15min，取上清，置于-20保存。關(guān)鍵詞:表達(dá),分離,結(jié)合,生長(zhǎng),因子,組織,醫(yī)學(xué)論文,結(jié)締組織生長(zhǎng)因子特異性結(jié)合肽的表達(dá)及分離純化 內(nèi)容摘要:本文由中國(guó)論文范文收集整理。 【摘要】 目