病原體抗原對γδT細胞細胞毒活性及細胞因子產(chǎn)生的影響

1、病原體抗原對T細胞細胞毒活性及細胞因子產(chǎn)生的影響【 摘要 】目的體外研究病原體抗原活化的T細胞的細胞毒和細胞因子產(chǎn)生的反應性以及對CD4+T細胞增殖的影響，以期進一步澄清T細胞的功能。 方法用洗淘法從外周血中分離純化出T細胞，在體外探討植物血凝素和結(jié)核分枝桿菌(M.tb)、人類6型皰疹病毒(HHV-6)和陰道毛滴蟲(TV)病原體抗原對T細胞的細胞毒活性和細胞因子產(chǎn)生的影響，并采用細胞隔離滲透培養(yǎng)法觀察T細胞分泌的細胞因子對CD4+T細胞增殖的作用。 結(jié)果M.tb比TV可更強地促進T細胞對K562細胞的殺傷活性。M.tb和HHV-6可刺激T細胞主要分泌TH1型細胞因子IFN-，而TV可刺激T細胞

2、優(yōu)勢產(chǎn)生TH2型細胞因子IL-6。經(jīng)抗原活化的T細胞分泌的可溶性因子可促進CD4+T細胞增殖。 結(jié)論細胞內(nèi)感染的病原體是激發(fā)T細胞產(chǎn)生TH1型細胞因子的誘導因子，并對其殺傷活性有所增強，而細胞外感染病原體可激發(fā)T細胞產(chǎn)生TH2型的細胞因子。【 主題詞 】受體，抗原T細胞細胞因子T淋巴細胞，細胞毒性CD4+T細胞 Effects of microbial antigens on the cytotoxicity and cytokine production of T cellsHe Wei,Lin Ying,Li Gang,et al.Institute of Basic Medicine C

3、hinese Academy of Medical Sciences & School of Basic Medicine,Peking Union Medical College,Beijing 100005【 Abstact 】ObjectiveIn order to investigate the function of T cells,this study has been focused on the cytotoxicity and cytokine production of pathogen-activated T cells as well as their influenc

4、e on the proliferation of CD4+ cells.Methods T cells were separated from peripheral blood of healthy donors by panning.After stimulated with PHA,Mycobacterium tuberculosis (M.tb),human herpes virus-6(HHV-6) and Trichomonas Vaginalis(TV), T cells were detected for their cytotoxicity and cytokine prod

5、uction,as well as effect of T cell-derived soluble factors on the growth of CD4+ cells in a semi-permeatable membrane co-culture system. ResultsM.tb could induce higher cytolytic activity of T cells predominantely to produce IFN-,while TV could trigger T cells mainly to secrete IL-6.The soluble fact

6、ors secreted by pathogen-stimulated T cells could promote the proliferation of CD4+ cells. ConclusionsIntracellular pathogens can be induciable factors for the production of TH1 type cytokines by T cells and promote the cytotoxicity of T cells,whereas the extracellular pathogen can induce T cells to

7、 produce TH2 type cytokines.【 Subject words 】Receptor,antigenT cellCytokinesT lymphocyte,cytotoxicityCD4+T cellsT細胞表達兩種抗原受體(TCR)，即分別由和鏈(TCR)及和鏈(TCR)組成的異質(zhì)二聚體。T細胞在外周血T細胞中所占比例很小，但在上皮中有較多分布，是防御病原微生物入侵的重要免疫細胞。體內(nèi)外研究表明，T細胞可對多種微生物抗原如結(jié)核分枝桿菌、人類6型皰疹病毒等的刺激產(chǎn)生增殖反應；對多種靶細胞如腫瘤細胞或病原體感染細胞產(chǎn)生細胞毒作用；可產(chǎn)生多種細胞因子，如白細胞介素(IL)-2

8、、干擾素(IFN-)等。T細胞在初次免疫應答中可能產(chǎn)生啟動效應1。大多數(shù)T細胞不表達CD4和CD8，識別抗原不受MHC分子的限制2，3。與T細胞比較，T細胞的功能尚不清楚。本研究通過洗淘法(panning)從正常人外周血中分離獲得了較高純度的T細胞，分析胞內(nèi)菌、寄生蟲及病毒抗原體外刺激下，T細胞的細胞毒活性改變與細胞因子分泌特點，并探討了T細胞分泌的可溶性因子對CD4+T細胞增殖的影響，以期為闡明T細胞在免疫應答中的作用機制提供進一步資料。材料與方法1.主要試劑：含10% FCS和RPMI 1640完全細胞培養(yǎng)基(GIBCO-BRL)；絲裂霉素C(MMC，Sigma)；植物血凝素(PHA)-P

9、(Serva);抗CD4、抗CD8及抗CD16單抗和熒光標記抗體(CD4-PE、CD8-FITC、CD16-FITC)、抗HLA-DR單抗、羊抗鼠Ig(gam-Ig)、抗TCR-PE及抗TCR-FITC熒光抗體(Immunotec-h)；放射菌素D(Sigma)；氚標記胸腺嘧啶核苷(H-TdR)：放射比活性3700kBq(即100Ci/ml)(中科院原子能所)；IL-2、IL-4、IL-6、IFN-、TNF-(邦定公司)。2.細胞系：CTLL-2細胞系由軍事醫(yī)科院趙明博士惠贈；7TD1細胞系購自北京醫(yī)科大學免疫系；人羊膜異倍體細胞(WISH)及其攻擊病毒-水皰口炎病毒(VSV)購自中國藥品生物

10、制品檢定所；L929細胞系由空軍總醫(yī)院劉麗博士惠贈；K562細胞系為我室自備。3.細菌、病毒及寄生蟲抗原：結(jié)核分枝桿菌(M.tb,H37RV,ATCC2561株)經(jīng)高壓滅菌，超聲粉碎，配成抗原懸液。6型人類皰疹病毒(HHV-6，GS株)由本室沐桂番教授惠贈，系在HBS-細胞中傳代培養(yǎng)的病毒株，用時反復凍融至少兩次，350g離心10分鐘，取上清備用。陰道毛滴蟲(TV)由本所劉寶豐教授惠贈，用前以Hanks液洗滌3次，350g離心10分鐘，置-20冰箱中滅活，備用。4.正常人外周血及CD4+T淋巴細胞的分離和鑒定：取正常健康獻血者(來自北京協(xié)和醫(yī)院血庫)新鮮外周抗凝血600毫升，用密度梯度離心法常

11、規(guī)分離外周血單個核細胞，然后用粘附法去除非粘附細胞，接著用E-玫瑰花環(huán)法分離E花環(huán)陰性(E-)非T細胞和E花環(huán)陽性(E+)T細胞。洗淘法(panning)分離純化CD4+和T細胞：抗CD4及抗CD8單克隆抗體6mg,溶于6ml溶液，加入100mm塑料平皿中，室溫放置40分鐘，棄上清，以PBS洗滌3次。每皿中加入5ml E+細胞懸液(23)107細胞，置4作用70分鐘。先將所有E+細胞以抗CD8抗體包被的平皿洗淘兩次(其中第一塊平皿包板時同時加入抗CD16及抗HLA-DR抗體各5mg，以去除巨噬細胞、B細胞等)。將所得CD4+T細胞留取部分備用，其余細胞再以抗CD4抗體包被的平皿洗淘2次。將所得

12、細胞按5mg/107細胞與抗CD4及抗CD8抗體混合，4冰箱中共育20分鐘，再經(jīng)gam-Ig包被的平皿洗淘(間接法)。取上清中CD4-CD8-細胞備用。CD4+和T細胞的鑒定(免疫熒光雙染色)：取洗淘法所得的細胞，每106個細胞分別加入抗CD4-PE和抗CD8-FITC或抗-PE和抗-FITC單抗各20l，4孵育20分鐘，用PBS洗滌(含1%牛血清白蛋白，0.1% NaN3)洗滌3次，染色固定液(PBS，含1%多聚甲醛、2%葡萄糖、0.1%NaN3)固定，再用流式細胞分析儀(FACScan,BD公司)分析各細胞組分的百分率。5.T細胞體外抗原刺激培養(yǎng)及細胞隔離滲透性培養(yǎng)體系：實驗方法參考文獻4

13、，具體為：于24孔培養(yǎng)板(NUNC)中每孔加入5105個T細胞和5105個MMC處理去增殖活性的來源于同一個體的E-細胞(E-細胞作為抗原呈遞細胞，MMC處理去增殖活性方法：每5106細胞加30mg MMC，于CO2溫箱孵育30分鐘，完全培養(yǎng)洗滌3次后備用)，1ml液體/孔。分設對照孔(僅加培養(yǎng)基)、PHA孔(PHA-P終濃度：1g/ml)、M.tb孔(M.tb終濃度：0.01%)、TV孔(含105蟲體/孔)及HHV-6孔(加入HHV-6培養(yǎng)上清0.3ml，感染覆蓋度約合0.003半數(shù)組織培養(yǎng)量/細胞)。按刺激時間，共設5個實驗組(12小時兩組、24小時組、48小時組和72小時組)。兩個12小

14、時組與刺激原作用12小時后，每孔取上清約0.5ml留作測定細胞因子用；取出所有細胞(約106)，用完全培養(yǎng)基洗滌3次，加入細胞隔離性滲透共培養(yǎng)體系的上層tissue culture insert(NUNC產(chǎn)品)中，下層24孔板孔中加入5105個CD4+T細胞，另設單純CD4+T細胞孔(上層insert中無T細胞)和非抗原刺激孔(上層insert中T細胞未經(jīng)抗原刺激)作對照，分別在共培養(yǎng)24小時及48小時測定CD4+T細胞的增殖。其余3組分別于24小時、48小時、72小時取上清0.5ml/孔測定細胞因子，其中24小時及48小時組同時測定T細胞的殺傷活性。6.細胞殺傷活性的測定：取抗原刺激24小時

15、/48小時孔的T細胞，計數(shù)，將其均分為3份(3105個細胞/份)加入96孔平底培養(yǎng)板(NUNC產(chǎn)品)中。其中兩個效靶混合孔按T細胞K562細胞=501的比例加入細胞，第三孔為T細胞對照；另設K562細胞作靶細胞對照，每孔液量200l。37，5% CO2孵育4小時后，每孔棄去100l上清，加15l MTT孵育4小時，每孔加入MTT溶液100l置溫箱中，8小時后在ELISA測定儀上測其吸光度值(A值)，測定波長570nm,參考波長630nm。按下列分式計算殺傷活性(以殺傷百分比表示)：7.細胞增殖實驗：取出與T細胞共培養(yǎng)24小時或48小時的CD4+T細胞，計數(shù)，均分3孔(1.7105個細胞/孔)，

16、加入96孔U形底培養(yǎng)板中，每孔加3 H-TdR 37kBq(1Ci)，孵育8小時，細胞收集，用液閃儀測定cpm值。8.細胞因子生物活性的測定：IL-2測定 采用CTLL-2細胞增殖反應MTT比色分析法4。IL-6測定 采用7TD1 IL-6依賴細胞株增殖實驗5。TNF-的測定采用L929細胞MTT法6。IFN-的測定參見文獻7，用MTT法測定。9.統(tǒng)計學方法：所有實驗數(shù)據(jù)均首先經(jīng)方差分析，發(fā)現(xiàn)存在顯著差異的實驗組(P0.05)后，再于組內(nèi)作t檢驗，兩兩比較組內(nèi)各數(shù)據(jù)間差異的顯著性，以P0.05表示有顯著差異；P0.01表示有極顯著差異。結(jié)果1.洗淘法可獲得較高純度的和CD4+T細胞：以洗淘法分

17、離純化的CD4-CD8-T細胞，其純度可達90%以上，其中T細胞占75%以上；CD4+T細胞的純度達85%以上。1顯示了一次代表性實驗中免疫熒光雙染色FACS分析檢測T細胞及CD4+T細胞純度的結(jié)果。如1所示，在洗淘前E+細胞中CD4-CD8-細胞占25%，而CD4+CD8-和CD4-CD8+細胞分別為47%和26%(1-A)；以洗淘處理后，可獲得具有86%純度的CD4+CD8-的細胞富集群體(1-B)，其中幾乎無CD4-CD8+T細胞，但仍混有12% CD4-CD8-細胞，可能以T細胞為主。在CD4-CD8-T細胞群體中，T細胞群體占77%(1-D)，該群體中仍存有6%TCR +細胞和17%

18、的TCR - TCR -細胞。這些雙TCR陰性細胞可能為NK細胞及少數(shù)B細胞。結(jié)合1-C進行分析，純度為93%的CD4-CD8-細胞分離是很成功的，僅有7%CD4-CD8+細胞殘存其中。由于少數(shù)TCR+細胞表面也可表達CD8分子，這樣在所得CD4-CD8-群體中可能還含有少量的TCR+ CD8+細胞?？傮w來說，經(jīng)洗淘法分離實驗目的細胞，效果較理想。1洗淘法分離人外周血及CD4+T細胞的效果免疫熒光分析Fig 1. Immunofluorescence analysis of panning-separated human peripheral and CD4+ T cellsE+lymphoc

19、ytes before panning (A),panning-separated CD4+ T cells (B) and panning-separated CD4-CD8- cells(C,D) were stained with CD8-FITC and CD4-PE(Panel A-C）and TCR and TCR (Panel D) respectively.One result of three experiments is shown2.PHA或某些病原體的體外刺激可增強T細胞對K562細胞的殺傷活性：表1所示，未經(jīng)PHA-P或抗原刺激的T細胞對K562靶細胞仍可顯示一定的細

20、胞毒活性，其殺傷活性隨培養(yǎng)時間延長有增加的趨勢。T細胞以PHA-P和M.tb刺激24小時后，二者的殺傷百分比均高達73%，其殺傷活性明顯高于TV及對照組(P0.050.01);刺激48小時后，除PHA組與對照間仍存在差異外(P0.05)，余者間并無統(tǒng)計學意義上的差異。 表1抗原刺激的T細胞對K562細胞的殺傷活性Table 1. Cytotoxicity of antigen-stimulated T cells to K562 cellsControlPHA-PM.tbTVHHV-624 hours2612734*734*4611501848 hours37136511*452149 264

21、16Data are expressed as the mean standard deviation of the percentages of cytotoxicity(%) from three experiments.Compared with control,*P0.01; *P0.05.At 24 hours of culture,PHA vs TV groups, P0.05, M.tb vs TV, P0.05. 3.PHA和某些病原體對T細胞分泌細胞因子的影響：靜息T細胞在體外可分泌IL-2，HHV-6的刺激使其產(chǎn)量顯著地增高。誘生T細胞產(chǎn)生IL-6時，TV作用強于HHV-6

22、、PHA-P和M.tb；而誘生IFN-時，HHV-6、PHA-P和M.tb的刺激效果明顯強于TV。如2-A所示，抗原刺激12小時，對照組無IL-2產(chǎn)生，而各實驗組已有明顯的產(chǎn)量(與對照比，P0.01)，其中HHV-6組含量最高，與其它組間存在極顯著差異(P0.01)。各組IL-2的產(chǎn)量隨培養(yǎng)時間延長而增高。至24小時，除HHV-6組外，其余組與對照組間已無顯著不同。刺激48及72小時后，各組間水平無顯著性差別。無任何刺激的T細胞仍可產(chǎn)生一定水平的IL-2。如2-B所示，培養(yǎng)24小時，各刺激組含量有明顯升高(與對照比，P0.01)；其中TV刺激組產(chǎn)量最高，高出對照組近2倍，與其余各組間的差異也很

23、明顯(P0.05P0.01);HHV-6和PHA組的產(chǎn)量也明顯高于M.tb組(P0.05)。48小時后，各組間差異消失。如2-C所示，在整個培養(yǎng)期，對照組IFN-的產(chǎn)量始終較低。而其它各組的IFN-的產(chǎn)量顯著增高(與對照比，P0.050.01)。HHV-6組產(chǎn)量隨培養(yǎng)時間的延長持續(xù)升高；而M.tb組產(chǎn)量在72小時達高峰(與對照比P0.01)。相比之下，PHA和TV組的水平相近，TV組的產(chǎn)量最少。HHV-6組和TV組間在48小時和72小時有極顯著差異(P0.01)。M.tb組在72小時與TV組間也出現(xiàn)極顯著差異(P0.01)。本實驗中，各刺激組及對照組間TNF-的分泌未出現(xiàn)有統(tǒng)計學意義的差別(P

24、0.05)。體外培養(yǎng)12小時各組的TNF-量就已經(jīng)達最高值。此后各組產(chǎn)量持續(xù)下降(2-D)。2抗原刺激的T細胞的細胞因子產(chǎn)生Fig 2. Production of cytokines secreted by antigen-stimulated T cellsData are expressed as the mean of bio-activity (U/ml) of cytokines (panel A:IL-2; panel B:IL-6; panel C:IFN-; panel D:TNF-)produced by antigen-stimulated T cells from th

25、ree experiments4.抗原活化的T細胞所分泌的細胞因子可誘導CD4+細胞產(chǎn)生增殖：經(jīng)與T細胞隔離培養(yǎng)24小時后，CD4+細胞出現(xiàn)增殖反應。各刺激組細胞增殖強度與對照間均存在顯著差異(P0.050.01)，其中HHV-6組與對照組差異極顯著(P0.01)。48小時時各組與對照間差異消失(表2)。 表2與抗原刺激的 T細胞滲透性隔離共培養(yǎng)時CD4+細胞的增殖反應Table 2. Proliferation of CD4+ cells when co-cultured with antigen-stimulated T cells in a semi-permeable co-cultu

26、re systemControl 1Control 2PHA-PM.tbTVHHV-624 hours334545241752710948*27131094*2654504*2152294*48 hours5388920554342726984206378920951631604513Data are expressed as the meanstandard deviation of cpm from three experimente.Compared with control, *P0.01;*P0.05.There is no difference among the antigen-

27、stimulated groups (P0.05).CD4+ cells were co-cultured with PHA-P/antigen-stimulated or non-antigen-stimulated (control 2) T cells or without T cells (control 1) 討論獲得高純度的目的細胞是開展免疫學體外實驗研究的一個重要前提。借助流式細胞儀分離技術(shù)無疑可獲得純度很高的目的細胞，但由于所需儀器及試劑價格昂貴，技術(shù)復雜，使其應用受到限制。而洗淘技術(shù)具有方法簡便，分離純度較高的優(yōu)點。在分離CD4+CD8-細胞時，利用洗淘法有效地去除了E+細胞

28、中的CD4-CD8+細胞。在CD4-CD8-細胞群體中，殘留少量CD8+細胞，這可能與抗CD8抗體的效價較低有關。少量殘存的CD8+細胞中也可能含有T細胞，因為有少數(shù)T細胞表達CD8分子。據(jù)報道，T細胞在受到抗原刺激時，可對腫瘤細胞或微生物感染的宿主細胞表現(xiàn)出較強的細胞毒活性，并被認為是T細胞參與抗感染免疫或腫瘤免疫的主要效應之一1。與文獻報道類似，未經(jīng)PHA或病原體刺激的T細胞對K562細胞有天然的細胞毒作用，并隨著培養(yǎng)時間的延長有所增強1。此種細胞毒作用在體外可被PHA或M.tb的抗原刺激所大大增強；此兩者的促進作用明顯高于TV的刺激。PHA是一種多克隆T淋巴細胞活化劑，而M.tb則是T細

29、胞的強激活劑，可激發(fā)T細胞(主要是V9/2亞群)對受M.tb作用過的靶細胞的殺傷8。上述發(fā)現(xiàn)在細胞過繼免疫治療中有一定積極意義。若將T細胞在體外經(jīng)M.tb活化后回輸病人體內(nèi)有可能產(chǎn)生明顯的殺瘤作用。此外，作為細胞內(nèi)感染的病原體M.tb，其促T細胞殺傷效應明顯強于可侵入陰道上皮內(nèi)的寄生蟲和引起細胞外感染的TV。這似乎提示胞內(nèi)感染微生物比胞外感染病原體對T細胞的腫瘤細胞毒更具有增強能力。雖然HHV-6也引起細胞內(nèi)感染，但這類病毒可引起PHA活化的T細胞的死亡9，故HHV-6刺激后T細胞殺傷活性未見明顯升高可能與此有關。未接觸抗原的純真(naive)CD4+T細胞(TH0型)可根據(jù)接觸不同性質(zhì)的病原

30、微生物而發(fā)生不同的分化；如接觸胞內(nèi)感染微生物后分化為TH1型細胞，主要分泌IFN-、IL-2等細胞因子，參與抗胞內(nèi)感染的細胞免疫；而細胞外感染病原體則誘導TH0型細胞分化為TH2型細胞，主要分泌IL-4、IL-6等細胞因子，參與抗胞外感染的體液免疫。晚近報道，在初次接觸引起胞內(nèi)感染的李斯特菌時，小鼠體內(nèi)T細胞可分泌大量的IFN-，而只產(chǎn)生少量IL-4。T細胞產(chǎn)生IFN-的量遠遠高于CD4+T細胞，其分泌高峰出現(xiàn)的時間也早于后者；而對引起細胞外感染的巴西日圓線蟲，T細胞IL-4的分泌出現(xiàn)較CD4+T細胞早且高的分泌峰，并低水平分泌IFN-10。在初次免疫應答中，T細胞針對不同性質(zhì)抗原分別產(chǎn)生TH

31、1或TH2樣細胞因子。這一特點對CD4+TH0細胞向TH1或TH2分化可能至關重要。因為TH0型TH1型的分化需要IFN-，TH0型TH2型的轉(zhuǎn)化需要IL-4或其它TH2型因子。在初次免疫應答中，不同抗原刺激T細胞分泌不同的細胞因子，可能為TH1或TH2細胞的分化提供了主要的旁分泌細胞因子來源。我們發(fā)現(xiàn)，HHV-6誘導T細胞產(chǎn)生IL-2的能力最強，而M.tb及HHV-6誘導T細胞產(chǎn)生IFN-的能力最顯著。HHV-6屬于一種親淋巴細胞的人類皰疹病毒。它可感染CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞、B細胞及單核吞噬細胞。已發(fā)現(xiàn)HHV感染可誘導CD4+T細胞分泌IFN-11。由本實驗結(jié)果可見，胞內(nèi)

32、感染病原體M.tb及HHV-6可導致T細胞優(yōu)勢產(chǎn)生TH1型細胞因子；胞外感染TV則刺激T細胞主要分泌TH2型細胞因子(IL-6)。有關上述現(xiàn)象的意義，目前尚無定論，可能與初次免疫應答中CD4+TH0細胞的分化有關。本實驗同時觀察了細胞隔離性滲透共培養(yǎng)體系中經(jīng)抗原刺激的T細胞對CD4+T細胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各刺激組均可誘導CD4+T細胞增殖反應，盡管增殖水平較低。這可能與T細胞分泌的細胞因子的量遠少于CD4+T細胞，或本實驗中T細胞及CD4+T細胞數(shù)量較少等因素有關。盡管如此，我們的結(jié)果也從一個側(cè)面證實了T細胞對CD4+T細胞的促增殖作用。另外T細胞可自發(fā)產(chǎn)生微量TNF-，所測抗原或PHA

33、刺激對這一效應無顯著影響。T細胞在無任何抗原刺激情況下即可分泌一定水平的IL-2，這是令人感興趣的。日后我們將比較它與CD4+細胞在此方面作用的異同。T細胞在胞內(nèi)感染微生物如M.tb刺激下即主要產(chǎn)生IFN-和IL-2，而同一條件下，該細胞對K652細胞的細胞毒效應也明顯增強。提示這種增強與T細胞在該條件下特征性分泌IFN-和IL-2有關。不同性質(zhì)(胞內(nèi)或胞外病原體)的抗原選擇性影響CD4+細胞的細胞因子分泌譜，而這些抗原對小鼠和人類T細胞的細胞因子產(chǎn)生多樣性似乎亦有上述影響。不同細胞因子基因的表達似乎與一定的病原體有關，闡明其機制將有助于了解體內(nèi)復雜的細胞因子網(wǎng)絡。志謝：趙明博士、劉麗博士、劉

34、寶豐教授及沐桂番教授為本研究提供了有關細胞系與抗原，對此僅表示衷心的感謝!本文受國家教委留學回國人員科研經(jīng)費和95年醫(yī)科院科研基金資助作者單位：100005 北京，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所、中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院參考文獻1Kabelitz D.Human T lymphocytes.Int Allergy Immunol,1993,1021-9.2Bluestone JA, Matis LA. TCR -minor redundant T cell subset or specialized immune system component? J Immunol,1989,1421758-1788.3Stefan H, Kaufmann E. / and other unconventional T lymphocytes:what