維拉帕米和生脈注射液對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用

1、維拉帕米和生脈注射液對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用        作者：山峰 何俊峰 宋暖 劉淑紅 李堃 王靜 王秋波 【摘要】 目的 觀察維拉帕米和生脈注射液對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用。方法 將40只大鼠分為假手術(shù)組（A組）、缺血再灌注組（B組）、維拉帕米組（C組）和生脈注射液組（D組），每組10只。A組開腹后再                

2、                   作者：山峰 何俊峰 宋暖 劉淑紅 李堃 王靜 王秋波 【摘要】  目的 觀察維拉帕米和生脈注射液對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用。方法 將40只大鼠分為假手術(shù)組（A組）、缺血再灌注組（B組）、維拉帕米組（C組）和生脈注射液組（D組），每組10只。A組開腹后再關(guān)腹；B組開腹后夾閉左肝蒂30 min，再關(guān)腹；C組在開腹前靜脈注射維拉帕米，開腹夾閉左肝蒂30 min，再關(guān)腹

3、；D組在開腹前3 d每天經(jīng)腹腔注射生脈注射液，開腹夾閉左肝蒂30 min，再關(guān)腹。各組均在關(guān)腹48 h后再開腹，每只大鼠取缺血肝組織檢測查丙二醛（MDA）、熱休克蛋白70（HSP70）的水平，光鏡下觀察肝組織的形態(tài)變化；取血檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、腫瘤壞死因子（TNF-）的水平。結(jié)果 B、C、D組ALT、AST、TNF-及MDA測定結(jié)果與A組比較均有顯著性差異（F=5.1053.01，q=1.3817.58，P<0.05）；C、D兩組ALT、AST、TNF-及MDA含量均低于B組，差異具有顯著性（q=2.8910.08，P<0.05），而C、D兩組以上

4、各指標(biāo)除ALT比較差異有顯著性（q=2.97，P<0.05）外，其他指標(biāo)比較差異無顯著性（P>0.05）。C、D兩組HSP70的表達明顯少于B組，而C組HSP70的表達略少于D組；C、D兩組肝細(xì)胞腫脹、壞死程度均較B組輕。結(jié)論 維拉帕米和生脈注射液可明顯改善大鼠肝臟缺血再灌注后肝組織的損傷程度。  【關(guān)鍵詞】  維拉帕米；生脈注射液；肝臟；再灌注損傷     ABSTRACT  Objective  To observe the protective effect of Verapamil and Shengma

5、i injection on ischemia-reperfusion injury in rat liver.    Methods  Forty healthy female Wistar rats were evenly randomized to sham operation group (group A), the abdomen was opened and then closed; ischemia-reperfusion group (group B), the blood supply of left hepatic lobe (LHL

6、) was clamped for 30 minutes, the abdomen was then closed; Verapamil group (group C), intravenous Verapamil was given before ope-ning abdomen, the blood supply of LHL was blocked as in group B, the abdomen closed; and Shengmai injection group (group D), Shengmai injection was administered intraperit

7、oneally three days before the experiment. The ischemia of the LHL was done same as in groups B and C. The liver tissue was collected at 48 hours after the procedures and sent for detection of heat shock protein 70 (HSP70), Malondialdehyde (MDA). Serum tumor necrosis factor alpha (TNF-), alanine amin

8、otrasferase (ALT), and aspartate aminotrasferase (AST) were measured.  Results  Compared with group A, the levels of ALT, AST, TNF- and MDA in groups B, C and D were significantly different (F=5.10-53.01,q=1.38-17.58,P<0.05). The ALT, AST, TNF- and MDA in groups C and D were significant

9、ly decreased than those in group B (q=2.89-10.08,P<0.05). Except of the significant difference in ALT  between groups C and D (q=2.97,P<0.05), no significant differences of other parameters were found between this two groups. The expression of HSP70 in groups C and D was obviously lower t

10、han that in group B. While the HSP70 in group C was slightly decreased than that in group D. Compared with group B, the liver cellular edema and necrosis in groups C and D were effectively alleviated.   Conclusion  Verapamil and Shengmai injection can improve ischemia-reperfusion dama

11、ge of rat liver.     KEY WORDS  Verapamil; Shengmai injection; Liver; Reperfusion injury     肝臟缺血再灌注損傷是近些年肝臟外科特別是移植外科的研究熱點之一。導(dǎo)致肝臟缺血再灌注損傷的原因很多，其確切的發(fā)病機制仍不十分清楚。近年研究結(jié)果提示主要與以下多種因素有關(guān)：肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、氧自由基生成、細(xì)胞因子的參與、Kupffer細(xì)胞激活及中性粒細(xì)胞的聚集、內(nèi)皮素和一氧化氮濃度的失衡和微循環(huán)功能障礙等1，其中最為主要的是細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載和氧

12、自由基生成。為了探討如何減輕肝缺血再灌損傷的方法，本研究通過動物實驗觀察了維拉帕米和生脈注射液對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。     1  材料與方法     1.1  動物分組     雌性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量180220 g。隨機分為假手術(shù)組（A組）、缺血再灌注組（B組）、維拉帕米組（C組）和生脈注射液組（D組），每組10只大鼠。     1.2  實驗方法     A組大鼠剖腹30

13、 min后再關(guān)腹；B組大鼠剖腹后，用無創(chuàng)血管夾夾閉大鼠左肝蒂30 min，然后關(guān)腹；C組大鼠經(jīng)尾靜脈緩慢注射維拉帕米（1.25 mg/kg），10 min后開腹，余同B組；D組大鼠于剖腹前3 d內(nèi)每日腹腔內(nèi)注射生脈注射液（5 mL/kg），剖腹前30 min向腹腔內(nèi)注射同劑量的生脈注射液，余同B組。均用30 g/L戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔內(nèi)麻醉。4組大鼠在關(guān)腹48 h后再開腹，每只大鼠均取缺血肝組織2塊，分別放入無菌小瓶中，1瓶送檢熱休克蛋白70（HSP70）、丙二醛（MDA），1瓶用40 g/L的甲醛溶液固定以備制作病理切片；由腹主動脈取血，分離血清檢測TNF-、ALT和AST。維拉帕

14、米由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，批號為3E12002；生脈注射液由常熟雷允上制藥有限公司生產(chǎn)，批號為0406031。     1.3  觀察指標(biāo)的測定     1.3.1  ALT、AST  用全自動生化分析儀測定。     1.3.2  TNF-  采用順序飽和液相競爭放射免疫分析法檢測，放射免疫分析試劑盒為北京中國原子能科學(xué)研究院產(chǎn)品。     1.3.3  MDA  取缺血肝組織勻漿，用硫代巴比妥酸法檢

15、測MDA的含量，試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。     1.3.4 HSP70 用Western blot法檢測缺血肝組織中HSP70的表達，抗HSP70單克隆抗體（一抗）和HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（二抗）購自北京中山生物技術(shù)有限公司。 1.3.5 肝組織形態(tài)學(xué)觀察 用40 g/L的甲醛                1.3.4  HSP70  用Western

16、 blot法檢測缺血肝組織中HSP70的表達，抗HSP70單克隆抗體（一抗）和HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（二抗）購自北京中山生物技術(shù)有限公司。     1.3.5  肝組織形態(tài)學(xué)觀察  用40 g/L的甲醛溶液固定缺血肝組織，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察、照相。     1.4  統(tǒng)計學(xué)方法     全部數(shù)據(jù)用SPSS（11.0版本）統(tǒng)計軟件處理，計量資料以x±s表示，統(tǒng)計處理采用方差分析，P<0.05為差異有顯著性。

17、    2  結(jié)    果     2.1  動物存活情況     因手術(shù)的原因，導(dǎo)致B組大鼠死亡1只，C、D組大鼠各死亡2只。     2.2  各組ALT、AST、TNF-、MDA結(jié)果比較     B、C、D組ALT、AST、TNF-及MDA測定結(jié)果與A組比較均有顯著性差異（F=5.1053.01，q=1.3817.58，P<0.05）；C、D兩組ALT、AST、TNF-及MD

18、A含量均低于B組，差異具有顯著性（q=2.8910.08，P<0.05），而C、D兩組以上各指標(biāo)差異除ALT比較有顯著性（q=2.97，P<0.05）外，其他指標(biāo)比較差異無顯著性（P>0.05）。見表1。     2.3  各組HSP70表達比較     C、D兩組HSP70的表達明顯少于B組，而C組HSP70的表達略少于D組；C、D兩組肝細(xì)胞腫脹、壞死程度均較B組輕。各組HSP70的帶寬和顏色深淺均不同，A組的色帶最窄、顏色最淡，提示有微量的HSP70表達；B組的色帶最寬、顏色最濃，提示HSP70的表達量

19、最多；而C組和D組的色帶較窄、顏色較濃，介于A、B兩組之間，與B組比較有明顯區(qū)別；C組和D組比較，C組的HSP70的表達又略弱于D組。     2.4  各組大鼠肝臟組織的病理改變     A組肝組織形態(tài)正常；B組大量肝細(xì)胞明顯腫脹，中央靜脈周圍肝細(xì)胞大量壞死；C組和D組肝細(xì)胞輕度腫脹，中央靜脈周圍肝細(xì)胞呈小灶狀或小片狀壞死，兩組之間無明顯區(qū)別，而與B組比較則有較明顯區(qū)別。 表1  各組ALT、AST、TNF-、MDA結(jié)果比較     3  討  

20、0; 論     肝臟缺血再灌注損傷是肝臟外科疾病中常見的病理生理過程，在休克的復(fù)蘇、嚴(yán)重的肝外傷、肝門阻斷的肝切除以及肝移植等過程中均不可避免地出現(xiàn)肝臟的缺血再灌注損傷，而它造成的組織損傷是影響上述疾病治療效果的重要原因之一。因此，如何減輕肝臟缺血再灌注損傷是肝臟外科研究熱點。     肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)病機制比較復(fù)雜，近些年對這方面的研究比較多，其中最主要的發(fā)病機制就是細(xì)胞內(nèi)鈣超載和氧自由基生成增多13。肝臟缺血再灌注時肝細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性降低，膜通透性增加，ATP產(chǎn)生減少，致大量Ca2+進入細(xì)胞內(nèi)， Ca2+激活細(xì)胞膜上的

21、蛋白酶和磷脂酶，破壞細(xì)胞膜的完整性，并且干擾線粒體的氧化磷酸化，引起嚴(yán)重的能量代謝障礙，導(dǎo)致肝細(xì)胞不可逆性損害。以下途徑造成氧自由基的增多：肝臟缺血再灌注過程中ATP分解代謝增加，分解產(chǎn)物次黃嘌呤大量堆積，產(chǎn)生大量氧自由基；低氧也使內(nèi)源性超氧化物歧化酶（SOD）失活或耗盡，SOD是體內(nèi)作用強大的抗氧化劑；缺血刺激激活Ca2+依賴蛋白酶，促進細(xì)胞內(nèi)有害的黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生，后者利用胞內(nèi)分子氧產(chǎn)生大量的氧自由基；細(xì)胞缺血、低氧也促進線粒體產(chǎn)生大量氧自由基4。氧自由基的大量產(chǎn)生損傷肝細(xì)胞膜的完整性，直接損傷肝細(xì)胞；還引起血小板、粒細(xì)胞在微血管中黏附、聚集，造成微循環(huán)障礙5；氧自由基還可直接氧化肝實質(zhì)細(xì)

22、胞核內(nèi)DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，引起DNA突變而造成肝臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷6。     本實驗以維拉帕米和生脈注射液為研究對象，觀察這兩種藥物對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用。維拉帕米是十分有效的鈣離子阻滯劑， NAUTA等7最早將其應(yīng)用于大鼠肝缺血后的再灌注損傷保護，發(fā)現(xiàn)維拉帕米在肝臟缺血前給藥可明顯減輕再灌注的損傷程度。在本實驗中，維拉帕米組的ALT、AST、TNF-、MDA等指標(biāo)均低于缺血再灌注組，有顯著性差異，HSP70的表達少于缺血再灌注組，組織病理亦顯示肝細(xì)胞腫脹輕、小灶性壞死，而缺血再灌注組的大量肝細(xì)胞壞死，提示肝損傷的程度較缺血再灌注組明顯減輕，與文獻報道結(jié)果相

23、符。此前已有醫(yī)生將維拉帕米應(yīng)用于手術(shù)中，以減少肝臟的缺血再灌注損傷8。     生脈注射液是將生脈散中的人參、麥冬、五味子制成可靜脈注射的藥物，含人參皂甙、麥冬皂甙、麥冬黃酮和五味子素等有效成分，中醫(yī)認(rèn)為其有益氣生津，復(fù)脈固脫之效。國內(nèi)應(yīng)用生脈注射液對器官和組織缺血再灌注的保護研究多集中在心、肺、腸黏膜以及休克狀態(tài)下的器官，而對肝臟缺血再灌注損傷保護研究的報道則極為少見。生脈注射液主要有以下藥理作用：耐低氧、改善微循環(huán)、抗炎、提高免疫功能、改善呼吸功能、增強心肌收縮力等8。有學(xué)者通過對動物腸黏膜缺血再灌注損傷保護作用的研究顯示，生脈注射液通過“多靶作用”發(fā)揮腸黏膜

24、保護效應(yīng)：清除氧自由基、調(diào)解細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、抑制NO酶的活性、增加腸黏膜灌注及氧合10。本實驗應(yīng)用生脈注射液在大鼠肝缺血前給藥，顯示ALT、AST、TNF-、MDA等指標(biāo)與缺血再灌注組比較有顯著差異，HSP70的表達比缺血再灌注組減少，組織病理也顯示肝細(xì)胞腫脹輕、壞死范圍小，提示生脈注射液對大鼠肝臟缺血再灌注損傷有明顯的保護作用。     從本實驗結(jié)果看，在大鼠肝臟缺血前給予維拉帕米和生脈注射液能夠有效地保護大鼠缺血肝臟的再灌注損傷，為這兩種藥物在臨床上的應(yīng)用提供了有力的實驗依據(jù)。 【參考文獻】   1梁浩暉. 肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生機制研究進展J. 肝膽

25、外科雜志, 2002,10(6):478-479. 2王萬鐵,林麗娜,王衛(wèi),等. 川芎嗪對肝缺血-再灌注損傷時黃嘌呤氧化酶活性的影響J. 中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志, 2003,10(6):340-342. 3王萬鐵,王衛(wèi),徐正,等. 肝缺血-再灌注損傷中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及左旋精氨酸的干預(yù)作用J. 中國危重病急救醫(yī)學(xué), 2003,15(2):91-93. 4CLARIEN P A, HARVEY P R, STRASBERG S M. Preservation and reperfusion injuries in liver allograftsJ. Transplantation, 1992,53(5):957-958.     5VOLMAR B, RICHTER S, MENGER M D. Leckucyte stasi-sin hepatic sinusoidsJ. Am J P