白沙枇杷成熟胚子葉誘導(dǎo)不定芽再生

1、5白沙枇杷成熟胚子葉誘導(dǎo)不定芽再生范晨昕,佟兆國(guó),袁衛(wèi)明,郄紅麗,張凱,王化坤,章鎮(zhèn)2222(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇南京210095;2.江蘇省太湖常綠果樹(shù)技術(shù)推廣中心,江蘇蘇州215107)關(guān)鍵詞:枇杷;成熟胚子葉;不定芽再生;AdventitiousonfromCotyledonsofMatureEmbryosofLoquatFANChen2xin,TONGZhao2guo,YUANWei2ming,QIEHong2li,ZHANGKai,WANGHua2kun,ZHANGZhen112222(1.CollegeofHorticulture,NanjingAgriculturalU

2、niversity,Nanjing210095,China;2.TaihuExtensionCenterforEvergreenFruitofJiangsuProvince,Suzhou215107,China)Keywords:loquat(EriobotryajaponicaL.);cotyledonofmatureembryo;adventitiousbudregeneration枇杷(EriobotryajaponicaL.)是原產(chǎn)中國(guó)的特色樹(shù)種,分紅沙、白沙兩大品系。因其基因型高度雜合,童期長(zhǎng),傳統(tǒng)的育種方法周期長(zhǎng),所以采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段育種顯得尤為重要?；蚬こ淌瞧贩N改良快速和有

3、效的育種手段,而基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化操作系統(tǒng)的建立依賴(lài)于不同類(lèi)型的外植體高頻植株再生。枇杷的離體培養(yǎng)植株再生主要集中在幼胚、胚乳、花藥以及原生質(zhì)體等方面161材料和方法1.1材料白沙枇杷甜種和冰糖種的當(dāng)年生成熟種子,取自江蘇省太湖常綠果樹(shù)技術(shù)推廣中心。1.2培養(yǎng)條件及方法,目前存在再生頻率低挑選大小均勻一致的成熟種子,用自來(lái)水沖洗干凈,在無(wú)菌操作臺(tái)上用75%乙醇浸泡30s,再用011%升汞表面消毒8min,然后用無(wú)菌水沖洗45次備用。剝?nèi)ヌ鸱N和冰糖種的種皮并將縱向刻傷的帶胚芽單瓣子葉接種在附加不同濃度TDZ(210mg/L,310mg/L,410mg/L和510mg/L)的MS基本培養(yǎng)基上,確定

4、不同基因型和TDZ濃度對(duì)成熟胚子葉再生不定芽的影響。下、培養(yǎng)難度較大等問(wèn)題7。近幾年在枇杷成熟胚子葉誘導(dǎo)再生方面相繼展開(kāi)了一些研究,但誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽?jī)H限于紅沙系品種8,9,白沙系品種至今未有報(bào)道。為此,本試驗(yàn)擬進(jìn)行白沙枇杷成熟種子子葉再生不定芽研究,試圖建立白沙枇杷成熟子葉再生體系,為以后通過(guò)基因工程改良枇杷品種奠定基礎(chǔ)。將表面滅菌后的冰糖種子葉進(jìn)行橫切,分成3段,分別為帶胚芽的子葉基部、不帶胚芽的子葉中部和子葉上部。沿子葉中心縱向剝開(kāi),分為帶胚芽單瓣子葉和去胚芽單瓣子葉,并縱向刻傷,分別接種在MS+TDZ410mg/L培養(yǎng)基上,比較不同部位外植體不定芽再生能力的差異。將冰糖種經(jīng)縱向刻傷后的單

5、瓣帶胚芽子葉接種在MS+TDZ410mg/L培養(yǎng)基上即進(jìn)行暗培養(yǎng),暗培養(yǎng)天數(shù)設(shè)14d、21d、28d3個(gè)處理,然后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)。收稿日期:2008204209基金項(xiàng)目:上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(滬農(nóng)科學(xué)工字2005第525號(hào))作者簡(jiǎn)介:范晨昕(19852),女,江蘇盱眙人,碩士研究生。(Tel)0252通訊作者:章鎮(zhèn),(Tel)025284395724;(E2mail)zhangzhen2njhot2試驗(yàn)所用的再生培養(yǎng)基均附加蔗糖30g/L、瓊脂515726江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2008年第24卷第5期g/L,pH為518。培養(yǎng)基在121條件下滅菌20min。暗培異顯著,其中大紅袍枇杷的子葉不定芽再生

6、頻率最高達(dá)8313%,而本試驗(yàn)所用的2個(gè)枇杷品種的再生頻率和外植體養(yǎng)21d(除暗培養(yǎng)天數(shù)篩選試驗(yàn)外)后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng),接種30d后轉(zhuǎn)接1次,培養(yǎng)基成分不變。培養(yǎng)溫度為(25±2),平均再生芽數(shù)也存在顯著差異,子葉離體再生能力,冰糖種優(yōu)于甜種。這可能是因?yàn)椴煌蛐筒牧弦蚱渖?、遺傳及對(duì)外界條件因子的敏感性不同而造成控制細(xì)胞分化的基因在植株中差異表達(dá)的結(jié)果10。外植體類(lèi)型的選擇對(duì)不定芽的再生也極為重要。就本試驗(yàn)中5種類(lèi)型外植體而言,從。另,與吳延軍的研究結(jié)果9一致,這可能是由于成熟胚子葉的胚軸連接處更富有分生組織較利于不定芽再生,也可能是由于帶胚芽的單瓣子葉在剝離過(guò)程中胚軸連接處在一定程

7、度上受到了損傷,從而促進(jìn)了不定芽再生。TDZ(Thidiazuron)是一種具有高生理活性的苯基脲類(lèi)細(xì)光周期為12h/12h,光照度為1000lx。1.3統(tǒng)計(jì)分析外植體接種5周后,統(tǒng)計(jì)子葉再生不定芽的外植體數(shù)和每外植體平均再生的芽數(shù)。計(jì)算不定芽再生頻率(再生不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%)、外植體平均再生芽數(shù)(外植體再生的總芽數(shù)/再生不定芽的外植體數(shù))。每處理設(shè)3次重復(fù),每重復(fù)接種5瓶,每瓶外植體數(shù)2個(gè)。2結(jié)果2.1品種不同,。在TDZ210mg/L時(shí)冰糖種子葉即能誘導(dǎo)不定芽發(fā)生,但是甜種在TDZ為310mg/L時(shí)才能誘導(dǎo)不定芽發(fā)生,說(shuō)明冰糖種比甜種對(duì)TDZ濃度的要求較低

8、。且相同濃度下,冰糖種的不定芽誘導(dǎo)胞分裂素,促進(jìn)再生的效果比BA高,尤其對(duì)較難再生的基因型品種效果明顯11,且能代替生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素促進(jìn)許多植物的體胚發(fā)生12。本試驗(yàn)中附加適當(dāng)水平的細(xì)胞分裂素TDZ就成功誘導(dǎo)枇杷子葉產(chǎn)生了不定芽。但是TDZ誘導(dǎo)芽再生成完整植株也伴隨著一些問(wèn)題,例如不利于芽生長(zhǎng),容易產(chǎn)生玻璃化苗和畸形苗等13,出現(xiàn)這些情況的原因也有可能與培養(yǎng)條件(例如培養(yǎng)基硬度、溫度和光照)有關(guān)。離體器官不定芽的形成在一定程度上受光敏色素的控制,暗培養(yǎng)有利于不定器官的形成14。本試驗(yàn)也證實(shí)暗培養(yǎng)有利于子葉不定芽的發(fā)生和提高不定芽質(zhì)量。但暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)使子葉整體愈傷化,外植體次生代謝物質(zhì)濃

9、度增加,從而導(dǎo)致子葉不定芽再生頻率以及不定芽質(zhì)量下降。率和外植體平均再生芽數(shù)都高于甜種,說(shuō)明基因型對(duì)白沙枇杷成熟子葉再生具有明顯影響。2.2TDZ濃度對(duì)子葉再生不定芽的影響隨著TDZ濃度的增加,甜種和冰糖種子葉不定芽再生頻率及外植體平均再生芽數(shù)均呈先升后降趨勢(shì),在TDZ濃度為410mg/L時(shí)均達(dá)到最高。當(dāng)TDZ濃度為510mg/L時(shí),盡管也獲得了較高的再生頻率和平均再生芽數(shù),但畸形苗和玻璃化苗數(shù)量明顯增多,表明TDZ410mg/L是枇杷子葉誘導(dǎo)不定芽再生的適宜濃度。2.3不同部位的子葉不定芽再生能力的差異外植體暗培養(yǎng)7d后,在子葉基部胚軸連接處和切口處產(chǎn)生愈傷組織;14d時(shí),胚軸連接處的愈傷組

10、織呈淡黃色,較緊密,并出現(xiàn)不定芽芽點(diǎn),而切口處的愈傷組織呈白色,較松軟;21d時(shí)轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)后,胚軸連接處呈現(xiàn)不定芽,并不斷變綠伸長(zhǎng),而切口處的愈傷組織逐漸褐化并死亡。試驗(yàn)中,只有帶胚芽子葉的胚軸連接處分化出了不定芽,子葉上部、中部及不帶胚芽的單瓣子葉經(jīng)誘導(dǎo)形成的愈傷組織沒(méi)有形態(tài)發(fā)生能力;縱向刻傷的帶胚芽單瓣子葉所誘導(dǎo)出的不定芽頻率和外植體平均再生芽數(shù)明顯高于橫切的子葉基部。2.4暗培養(yǎng)天數(shù)對(duì)子葉再生不定芽的影響參考文獻(xiàn):1何偉其.枇杷幼胚及莖頂培養(yǎng)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的研究J.中國(guó)園藝,1983,29(4):322.2滕世云,陳惠民.枇杷胚狀體的誘導(dǎo)和植株再生J.園藝學(xué)報(bào),1986,13(4):

11、2452249.3LINSQ,CHENZG,LINQL,etal.AStudyonthecultureofembryoandprotoplastinloquatandtheircarbonsourcesJ.ActaHorticulture,1995,403:3202323.4莊馥萃,潘維雄,吳金珠.枇杷胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)和異常器冰糖種子葉經(jīng)暗培養(yǎng)21d后不定芽再生效果最佳,再生頻率最高為5313%。暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短(14d)或過(guò)長(zhǎng)(28d)均不利于不定芽的產(chǎn)生。官的分化J.亞熱帶植物通訊,1982(2):7211.5LIJQ,WANGYQ,LINLH,etal.Embryogenesisandp

12、lantre2generationfromanthercultureinloquat(EriobotryajaponicaL.)J.SciHort,115(4):3292336.6林順權(quán),陳振光.枇杷原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株J.福建農(nóng)業(yè)大3討論枇杷成熟胚子葉再生不定芽研究較少,目前研究試材僅有紅沙品系的早鐘六號(hào)和大紅袍,前者是由胚狀體途經(jīng)發(fā)育成植株9學(xué)學(xué)報(bào),1994,23(1):125.7沈慶斌,賴(lài)鐘雄.枇杷離體培養(yǎng)研究進(jìn)展C/陳振光.植物組織培養(yǎng)和試管育苗.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2004:2072211.,后者是由愈傷組織分化成苗9,兩者再生頻率差范晨昕等:白沙枇杷成熟胚子葉誘導(dǎo)不定芽再生8沈慶斌.枇杷高頻率體胚發(fā)生體系的建立及其遺傳轉(zhuǎn)化初步72712徐曉峰,黃學(xué)林.TDZ:一種有效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑J.植物研究D.福州:福建農(nóng)林大學(xué),2005.9吳延軍,謝鳴,蔣桂華,等.枇杷成熟子葉及葉片不定芽再生學(xué)通報(bào),2003,20:2272237.13HUETTEMANCA,PREECEJE.TDZ:apotentcytokininforwoodyplanttissuecultureJ.PlantCellTissueOrganCult,1993,33:1052119.14DURHAMRE,KORBANSS.Highefficiencyshootregenerationfromi