鎘對植物葉片短期脅迫效應的紅外光譜研究

1、德州學院 生物系 2007屆 生物科學專業(yè) 畢業(yè)論文（設計）鎘對植物葉片短期脅迫效應的紅外光譜研究柯志剛 （德州學院生物系 山東德州 253023）摘 要：隨著現代工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染日益嚴重。其中，鎘是影響最為嚴重的元素之一，它能直接導致農作物減產甚至死亡。在鎘脅迫條件下，植物體內化學組成、物質含量和蛋白質構象發(fā)生了較大的變化。傅立葉變換紅外光譜（FTIR）技術是檢測這些變化較為理想的工具。本文以鎘脅迫條件下的三葉草葉片作為材料，利用FTIR技術初步探索了葉片中化學組成、物質含量及蛋白質構象的變化。關鍵詞：鎘脅迫； 傅立葉變換紅外光譜； 構象 1引言重金屬污染已成為環(huán)境生物學關注的焦點，當

2、土壤中重金屬離子超過其對重金屬離子的自潔作用時，將對植物代謝和生長發(fā)育產生影響。研究表明，重金屬污染中影響植物生長發(fā)育和代謝的主要是鎘(Cd)、鉛(Pb)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鈷(Co)和汞(Hg)等，其中又以鎘的影響最為嚴重。 鎘(Cd)被廣泛應用于機械、化工、電鍍、印染等部門，其毒性高、遷移性大。環(huán)境中的鎘對植物特別是農作物能產生較大的毒害效應。在鎘脅迫下，植物細胞內的糖、脂、蛋白質、核酸等生物大分子的組成、含量及結構都將發(fā)生一系列變化。鎘經食物鏈進入人體，能導致DNA突變，有強烈的致癌作用。據報道，鎘是排名第六的強致癌劑。1.1鎘污染及來源鎘是重金屬污染中常見的元素，自然

3、環(huán)境中鎘主要以正二價形式存在，可分為水溶性鎘、吸附性鎘和難溶性鎘。其來源包括自然和人為來源。（1）自然的鎘主要來源于巖石和礦物中的本底值從世界范圍來看，一般土壤中鎘的含量為0.012.00 mg/kg，平均為0.35 mg/kg。我國土壤中鎘的背景值平均為0.097 mg/kg, 95%置信度的含量范圍為0.0170.333 mg/kg。（2）人為來源的鎘主要來源于工業(yè)“三廢”和含鎘肥料大量施用工業(yè)廢氣是造成空氣鎘污染的主要來源，在偏遠地區(qū)的空氣中鎘的含量一般低于1.0pg/mL，但在工業(yè)區(qū)周圍的大氣中鎘的含量較高。較高含量的鎘通過降雨或沉降進入土壤，在土壤中積累。據統(tǒng)計，世界每年冶金廠和鎘處

4、理廠釋放到大氣中的鎘大約100萬kg，接近整個大氣污染總量的45%。工業(yè)廢水灌溉；鎘在電鍍、顏料、鎳鎘電池工業(yè)、電視顯像管制造中的應用非常廣泛，隨著采礦、冶煉和電鍍工業(yè)的不斷發(fā)展，大量的含鎘廢水排入河流中，用于灌溉必污染土壤。大量的工業(yè)固體廢棄物的堆積、農田施用污染的污泥、長期施用一些含鎘的農用化肥也必然會造成鎘在土壤中的大量沉積，造成土壤中鎘的總量增加。1.2鎘對植物的毒害效應Cd可能是通過皮層組織進入根部，再通過質外體或共質體通道到達木質部，在此與配體(如有機酸、植物螯合肽等)螯合，Cd2+大多存留在根部，少量運至地上部分；發(fā)育中的果實可能是經由韌皮部中介載體而積累Cd的5。鎘對植物的毒害

5、效應表現為許多方面，如抑制生長、影響光合作用及增加細胞膜通透性6。具體而言，分為以下幾個方面：根損傷 鎘首先引起根損傷。Cd2+損傷根尖的核仁，抑制RNA的合成及RNAase、核糖核酸酶及質子泵的活性；抑制硝酸還原酶的活性，減少根部對硝酸鹽的吸收及向地上部分的轉運；抑制根部Fe3+還原酶的活性，引起Fe2+虧缺19。Schutzen dubel 等的研究表明，在 Cd2+ 處理后，蘇格蘭松幼苗 H2O2的產生增加，抗氧化系統(tǒng)活性及根的伸長受到抑制，根尖細胞的老化加速17。影響水分的吸收 鎘對植物水分關系的影響已有較多的研究。通常Cd會降低植物對水分脅迫的耐性，在相對水分含量和葉片水勢較高時使膨

6、壓喪失。Cd降低細胞壁彈性，這可能是造成水分脅迫耐性降低的主要原因。Cd處理的植物表現出蒸騰速率降低和氣孔阻力增加，如促使單位葉面積上氣孔數量增加而氣孔面積減少，顯著降低植物的蒸騰速率和相對水分含量。Cd影響蒸騰作用除了通過改變氣孔孔徑外,主要還是通過影響水分運輸來實現的。據報道，Cd誘導木質部細胞壁退化，而這種退化減少了水分的運輸，加上由于根生長減少而導致植物對水分吸收的減少,從而引起植株的萎蔫。影響呼吸作用 Cd增加線粒體H+的被動通透性，阻止線粒體的氧化磷酸化。鎘處理可使植物氣孔阻力增加，其機理是Cd可直接影響保衛(wèi)細胞中離子和水分遷移。彭鳴等曾在研究Cd2+對玉米幼苗傷害時觀察到質體基粒

7、腫脹或解體的現象8。丁小余觀察到，在莼菜葉肉細胞中線粒體受重金屬毒害后，脊會首先發(fā)生解體，該結果再次驗證了“線粒體是對重金屬毒害較敏感的細胞器”這一結論。莼菜葉肉細胞的核仁在正常狀況下通常為單個圓形，但受Cd2+毒害后，核仁往往會分裂成多個碎塊狀2。抑制光合作用和蒸騰作用Cd進入植株葉片中以后，首先影響光合色素，使葉綠素總含量下降，進而影響光合功能。劉厚田等報道，Cd對分蘗期水稻葉片色素含量的影響最為明顯,在此生育期以Cd處理植株，其葉綠素含量顯著下降，且葉綠素b降低的比例大于葉綠素a7。通常重金屬對類胡蘿卜素的影響比葉綠素小，并抑制PS及光合磷酸化。Cd破壞光合器官，抑制RuBP羧化酶活性，

8、影響碳固定、葉綠素Hill反應、PS、PS活力，增加非光學猝滅等。降低葉片中的電導率，減少 CO2 吸收，干擾氣孔的開放。Sheoran等以木豆為材料，在其營養(yǎng)生長階段用20mmol.L-1 Cd2+進行處理，1d后CO2交換率即被抑制87%，氣孔導度和蒸騰作用率也相應降低，由此推斷Cd使木豆CO2交換率降低并不是某單一因素作用的結果，而是通過對氣孔導度、葉綠素含量和光合作用器官功能的綜合影響引起的18。Haag -Kerwer 等研究表明，在印度芥菜中，由于植物螯肽對 Cd2+的解毒作用，植物光合作用受到保護，但蒸騰速率和葉片的擴展生長仍受到抑制12。在蠶豆中，Cd2+經 Ca2+ 離子通道

9、進入保衛(wèi)細胞后，可能通過脫落酸(ABA)途徑引起氣孔的關閉，抑制植物的蒸騰作用。引起氧化脅迫 Cd2+ 結合酶活性中心或蛋白巰基，取代蛋白反應中心的必需金屬 Ca、Fe、Zn，釋放自由離子，誘發(fā)氧化脅迫，引起膜脂的過氧化，導致膜的損傷9。Cd產生氧化脅迫，但不是直接產生活性氧。它能損傷主要的生物大分子，增加膜脂過氧化作用，抑制以下幾種抗氧化酶活性：超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、ascorbate超氧化酶、谷胱甘肽還原酶等。1.3植物對鎘脅迫的響應機制 植物對重金屬的抗性主要有兩種方式:逃避和忍耐。大量的研究表明，不同基因型植物對重金屬Cd脅迫的適應性有明顯的差異。水稻葉片Cd

10、含量在2mg/kg時，可使產量降低25%；菠菜、大豆、萵苣在土壤Cd含量為413mg/kg時，產量降低25%；而西紅柿、南瓜、結球甘藍等，在土壤含量為160250mg/kg時，產量才降低25%10。某些植物如東方蓼、狼把草、野生莧、羊齒類鐵角厥屬、旱柳、苧麻以及一些藻類等，對土壤Cd脅迫有較強的適應。植物通過以下一些作用機理來應對Cd脅迫： 絡合機制絡合機制是植物解除鎘毒害的主要方式之一。早在80年代初期，許多學者認為Cd能誘導植物形成Cd結合蛋白(Cd-binding protein,簡稱Cd-Bp)，并且認為這是植物耐Cd的主要生理機制。何篤修等從玉米中提純獲得Cd結合蛋白，蛋白與Cd的比

11、例為13。進入細胞的Cd約有40%50%能被結合成Cd-Bp。Cd-Bp的形成，限制了自由態(tài)Cd存在，減輕了Cd對植物的毒害。然而，在過量的重金屬的脅迫下，植物體細胞無法誘導產生足夠的結合蛋白去結合重金屬離子，所以過量的重金屬離子會對細胞構成毒害4。目前，在植物中已發(fā)現有兩種重金屬結合肽:金屬硫蛋白(MT)和植物螯合肽(PCs)。MT是一類由基因編碼富含半胱氨酸的低分子多肽，可通過半胱氨酸殘基上的巰基與重金屬結合形成無毒或低毒的絡合物，從而降低重金屬毒害。然而在高等植物中最多的一類重金屬結合肽是PCs，PCs是一種由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸組成的Cd絡合多肽，其分子量較低，一般為2 4KD，化

12、學式為(-GluCys)nGly(n=2-11)。Grill的研究表明，PCs能結合10多種高等植物所吸收的90%的Cd。Cd2+進入植物后，首先與PCs結合形成LMW復合物，在hmt1膜轉運蛋白作用下轉入液泡內；S2-在hmt2膜轉運蛋白作用下進入液泡內。然后LMW復合物、PC、S2-和Cd2+在液泡內合成HMW復合物，并固定在液泡內。HMW復合物對植物的毒性較低，植物正是通過形成HMW復合物免受重金屬毒害。除PCs外，谷胱甘肽和各種聚羧酸對Cd也有螯合作用。區(qū)域化植物根系分泌物以及根系周圍的植物-微生物微系統(tǒng)均能防御Cd等重金屬進入植物根系。進入根系Cd首先被根部細胞壁及碳水化合物固定而束

13、縛于果膠位點。這是抗Cd脅迫的第一道屏障。Cd2+進入液泡后，被限制于一有限區(qū)域,不能再在胞質溶膠中進行自由循環(huán)，因而液泡固定化在排除Cd毒害和Cd耐受中起重要作用。Cd刺激植物合成植物螯合肽，并與之絡合形成貧S低分子量絡合物(LMW)，在液泡膜上結合酸不穩(wěn)定S2-，形成對鎘高度親和的高分子量絡合物(HMW)，并由液泡膜轉運蛋白HMTI蛋白轉入液泡中?？梢?Cd排除與植物螯合肽快速結合S2-、有效限制自由Cd2+有關。因而穩(wěn)定S2-組分的LMW在Cd排除中尤為關鍵。植物中Cd主要以HMW復合物的形式積累于液泡中。HMTI基因的大量表達可提高液泡中HMW復合物含量及植物耐Cd能力。Mg-ATP存

14、在時絡合物將通過特殊載體逆梯度勢跨越液泡膜，在液泡胞囊中積累。自由Cd2+可能通過Cd2+/2H+反向運輸進入液泡。液泡中酸性pH使HMW解離，Cd又被液泡內有機酸(檸檬酸、蘋果酸、草酸)、氨基酸絡合。脫輔基植物螯合肽被液泡水解酶降解，還于液泡中，繼續(xù)執(zhí)行穿梭角色?？梢娭参锏哪虲d能力與HMW復合物裝配速率成正相關,而與植物螯合肽合成速率無一定相關性。LMW復合物進入液泡的跨膜速度快于HMW復合物，推測LMW復合物的主要作用是將細胞中的Cd轉進液泡，而HMW復合物主要起聚集Cd和解毒作用。提高保護性酶系統(tǒng)的活性植物受Cd污染后，丙二醛(MDA)高度積累。膜脂過氧化是膜上不飽和脂肪酸中所發(fā)生的一

15、系列活性氧反應，其產物MDA含量是反映脂質過氧化作用強弱的一個重要指標。正常生長條件下，植物體內活性氧產生和清除處于平衡中，當處于各種逆境脅迫或衰老時，有利于體內活性氧的產生。積累的活性氧導致了膜脂過氧化，使植物生長異常。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是植物適應多種逆境脅迫的重要酶類，被統(tǒng)稱為植物保護酶系統(tǒng)。當植物受到污染后，SOD、POD和CAT發(fā)生相應變化，依品種及抗性的不同而異。如陳宏等用Cd處理小麥幼苗，經鎘脅迫處理后，隨著鎘濃度的增高，葉片和根系中的膜脂過氧化產物MDA的含量和POD活性明顯升高，SOD活性也有所提高1。然而酶對其保護作用也有一定

16、限度，即使是耐Cd植物，酶的活性也存在一個閾值。在一定的Cd濃度范圍內，3種酶活性得以維持或提高，超過這個范圍，它們的活性就下降，但下降的幅度要比耐性弱的植物小。 提高體內可溶性蛋白、脯氨酸含量植物體內可溶性蛋白、脯氨酸含量的提高，可以增加細胞滲透勢和功能蛋白的數量，有助于維持細胞正常代謝，提高植物的抗逆性。Cd能誘導可溶性蛋白含量的增加。有研究表明，低濃度的Cd能使小麥幼苗的脯氨酸含量增加。脯氨酸是一種重要的滲透調節(jié)物質，因而認為其含量的提高可能也是耐Cd植物適應Cd脅迫的機制之一。 逆境蛋白及基因表達目前,國內外開始重視從基因水平去研究植物抗污染的作用機理。Cd誘導玉米根中合成一種可被熱激

17、蛋白(heat shock protein,hsp)70抗體沉淀的70kD蛋白質,它能被除熱之外的因子激活，稱為熱激蛋白同源物(hsc)，是一種磷蛋白。玉米中hsc70可以限制和修復環(huán)境脅迫引起的蛋白質損傷16。用Cd處理水稻，也發(fā)現了同樣的結果。段昌群指出，植物抗污染基因來源于基因代換、基因突變和基因交換，在強大有力的污染選擇條件下，植物抗性基因得以迅速擴展3。1. 4紅外光譜技術在逆境條件下植物研究中的應用紅外光譜原理分子中的原子通過化學鍵相互連接，其鍵長、鍵角不是固定不變的。整個分子在不停地振動。分子振動能級的躍遷可由紅外光輻射提供能量。如果用不斷改變波長的紅外光照射樣品，當某一波長的頻

18、率剛好等于分子某一化學鍵的振動頻率時，分子就會吸收紅外光產生吸收峰。傅立葉變換紅外光譜技術在逆境下植物研究中的可行性 20世紀70年代興起的傅立葉變換紅外光譜儀(簡稱FTIR spectrometry) 具有掃描速度快、光通量大、高分辨率、高信噪比、測定光譜范圍寬的特點，并配備有功能很強的計算機系統(tǒng)，所以被廣泛應用于生物學研究。例如，利用FTIR技術對比分析了組成羽毛的蛋白與組成種子（以大麥，燕麥及小麥為材料）的蛋白的二級結構的區(qū)別。發(fā)現組成羽毛的蛋白的二級結構中beta-sheet占絕大部分，而在組成種子的蛋白中，alpha-helix占多數。推測不同的蛋白所含的各種二級結構的比例不同與其在

19、生物體中的消化行為不同有關21；蛋白質多肽鏈中CN鍵的吸收峰的位置和形狀主要受其二級結構的影響，受其他因素影響較小。利用變性劑作用于蛋白質，增加無規(guī)卷曲在二級結構中的百分比。利用CN鍵吸收區(qū)中對應于beta-sheet和無規(guī)卷曲的吸收峰，鑒定beta-sheet和無規(guī)卷曲，并利用紅外光譜圖對各種二級結構的百分比進行評估11；Hoekstra FA等利用FTIR技術研究蔗糖對Typha latifolia L 的完整花粉粒膜相行為影響的研究13；Oldenhof H等利用FTIR技術研究了在水楊酸處理條件不同時，蘚類植物的膜相行為及總體蛋白二級結構的變化。研究發(fā)現在水楊酸處理下，植物糖含量增加，

20、而糖是其作為冷凍干燥的防御機制15。傅立葉變換紅外光譜儀在生物樣品研究中還具有以下幾個重要的優(yōu)點：能在分子水平上直接了解所研究分子或體系的結構，得到基因生物功能信息，新化學鍵的形成及類型，以及環(huán)境對生物樣品的影響；紅外光譜樣品三態(tài)均可，用量少，不破壞樣品結構，即可研究樣品的表面結構，又可研究樣品的整體結構；經過計算機數據處理，水的吸收峰從樣品譜中扣除，重疊的峰經過傅立葉去卷積可分開。由于FTIR技術的上述諸多優(yōu)點，以及逆境條件下植物細胞中的一系列變化，所以其是逆境條件下植物研究的理想工具。用FTIR研究在鹽脅迫下鹽生植物Ice plant和淡土植物 Arabidopsis體內化學組成和蛋白質二

21、級結構的變化亦有報道14。1.5利用FTIR技術研究鎘脅迫下植物的意義化學組成的變化反映了細胞總體代謝過程的變化。在逆境研究中，FTIR技術比傳統(tǒng)的研究方法更為靈敏和有效。本文即以FTIR技術研究了鎘脅迫對植物細胞中化學組成、物質含量及結構的影響，從生化上初步探索了鎘脅迫對植物危害的機理。在可檢索的范圍內，國內外尚未有相關報道。2實驗材料與方法2.1實驗材料 生長一致的三葉草葉片。2.2試劑 KBr（購自Sigma公司，光譜純）2.3儀器 尼力高紅外光譜儀（FTIR-NEXUSTM傅立葉變換紅外光譜儀，測定區(qū)域4000400cm-1，掃描次數32次，分辨率4cm-1）2.4樣品處理及測定取數片

22、長勢相同的三葉草葉片，經不同濃度的鎘溶液浸泡不同時間，得三組樣品，如下：樣品號 濃度 時間對照 0 2h3號 15mg.L-1 24h5號15mg.L-11h 將三組三葉草葉片用去離子水清洗后，經120殺青一小時，再80烘干至恒重，粉碎，過200目篩。各組分別取樣品2mg、KBr200mg放入瑪瑙研缽中研磨并混合均勻，將混合物小心倒入壓模中，使樣品在模中均勻堆積，用壓桿略加壓使之完全鋪平，裝配好后，在真空條件下，緩慢加壓至約為15Mpa，維持一分鐘，即可得樣品薄片。將所得到的薄片放入準備好的紅外光譜儀測定系統(tǒng)中，經測定得各組樣品的原始紅外光譜數據。3結果與分析3.1原始紅外光譜數據由尼力高紅外

23、光譜儀采集了對照、3號和5號處理葉片的紅外光譜數據，結果如圖.1所示，實驗結果表明本實驗得到的3個處理的紅外光譜圖，在中紅外區(qū)未見到明顯的H2O和CO2干擾，可以用于隨后的分析。 A B C圖.1 紅外光譜原始數據注：A：對照葉片 B：3號樣品 C：5號樣品對3個圖譜利用Omnic7.0軟件自帶peak search功能，發(fā)現不同的處理導致峰的位置與數量明顯不同，具體數據見表1：表1 不同樣品的峰的位置、強度及峰的數量樣品 峰的位置 峰的強度 峰的數量對照 3383.56 23.551 102925.67 39.7921734.21 43.154 1651.79 30.016 1539.51

24、41.523 1446.93 42.581 1369.14 40.132 1228.23 39.277 1047.89 30.406 607.49 46.632 3號 3364.58 29.101 82923.31 40.355 1650.69 31.416 1537.07 42.064 1368.68 42.091 1233.45 42.289 1047.71 33.555 613.10 49.690 5號 3357.28 11.191 7 2925.45 17.604 1653.97 13.329 1541.43 19.915 1444.15 21.351 1236.09 22.073 1

25、047.92 14.367從上表中可知，鎘處理能減少樣品中峰的數量。在對照樣品中，峰的數量為10個，而3號及5號分別有峰8個和7個，這一結果表明，鎘處理下，葉片細胞中物質組成減少了。另外，經鎘處理以后，峰的位置及強度也發(fā)生了改變，如對照樣品中3383.56 cm1處峰的強度為23.551，而在3號中其位置變?yōu)?364.58 cm1，強度為29.101，在5號樣品中，相應的峰的位置在3357.28 cm1處，強度是11.191，這一結果意味著在鎘脅迫下，植物細胞中某些物質的種類及含量發(fā)生了改變。3.2原始圖譜的進一步處理由于測定時一般不仔細稱量樣品與KBr粉末的質量，不同的測定數據存在不均一性，

26、不能直接進行定量研究，因此本實驗中利用Omnic軟件的圖譜加工功能，對所得圖譜進行了進一步處理，以便進行定量與定性研究。主要進行了基線校正，平滑化和均一化22，結果如圖.2所示。 A B C圖.2 處理后的光譜圖注；A：5號樣品 B：3號樣品 C：對照結果表明，3個光譜圖數值分布在01.0之間，4000 cm1處起始數值為0，符合實驗要求。利用OMNIC和Knowitall軟件，對處理后的光譜數據進行了峰識別和不同處理對峰位置的影響分析。利用Knowitall軟件的峰基團查找功能，得到對照葉片主要由蛋白質、糖、脂及核酸組成：在3378cm1位置存在較高的峰，代表了OH和NH的伸縮振動，這種振動

27、主要來自蛋白質和碳水化合物20；在2956和2925cm1位置存在著2個中等強度的峰，代表了CH基團的伸縮振動20；在12001500 cm1區(qū)域內，是C-H基團的彎曲振動，但是有不同程度的重疊，因為利用Knowitall軟件尋找，發(fā)現存在多種基團的特征峰（結果未顯示）22。在20001000 cm1間存在著許多尖銳的峰，表明正常葉片含有豐富的化合物14。在1745 cm1處存在一個低強度的峰，代表了COOR基團的振動，這些基團主要來自含酯鍵的化合物，如膜脂和細胞壁的果膠成分14。1444cm1處的峰可能代表了COO-基團的振動。尤其重要的是在1651，1539和1228cm1處均有不同強度的

28、峰，分別代表了amide I，amide II和amide III峰，它們分別是CO，NH和CN基團的振動，這3個峰對于研究蛋白結構的變化具有重要意義20。這些結果表明本實驗中得到得紅外圖譜能夠反映葉片這樣一個復雜體系中不同物質與基團的紅外光譜特征。利用同樣的軟件，分析了5號與3號處理葉片的紅外光譜特征，結果如圖.3所示，結果表明不同處理間的紅外光譜特征存在著明顯差異，表現為除了峰的強度與未處理葉片圖譜對應的峰有所差別之外，峰的位置與數量也有所不同，表現之一為3000cm1左右的峰圖形有明顯變化；另外在1541至1050cm1間，在峰的位置與數量上存在明顯差異。3號處理的葉片與對照相比，也存在

29、著明顯的差異，其趨勢與5號處理葉片類似，但是程度不同（見圖.4）。 可以發(fā)現3號與5號處理在20001000 cm1間的峰圖形與對照葉片相似，但是明顯的表現為峰較寬，這可能是因為出現了新的化合物或已有化合物間的作用模式有所變化14。引人注意的是，3號處理是15mg.L1鎘溶液處理24h，而5號是15mg.L1鎘溶液處理1h，但是3號處理的光譜圖形更接近于對照葉片，這是否反映了較長時間的脅迫使植物葉片有足夠的時間來消除脅迫的影響尚待進一步研究。圖.3 2種處理紅外光譜的比較注：紅色表示3號處理，藍色表示對照處理圖.4 3種處理紅外光譜的比較注：紫色是對照，綠色是3號，紅色是5號3.3光譜數據的F

30、ourierselfDeconvolution和定性分析由于在一個復雜體系中，不同物質的振動峰相互干擾，導致在一些區(qū)域的重要信息不易發(fā)現，一般利用FourierselfDeconvolution或利用一階及二階導數的方法來進一步分離相近的振動峰23。在本實驗中對5號圖譜利用FourierselfDeconvolution（FSD）處理。1處區(qū)域，變換的結果與原始圖譜明顯不同，原1738cm1所代表的酯峰可分為1737cm1和1709cm12個峰，同時指紋區(qū)的圖形也有變化，表明酯類物質的組成有所變化；另一個主要的變化是amide I和amide II峰有明顯的變化，表現在峰的數量明顯增加。圖.5

31、 對照光譜的FSD變換結果圖.6 5號處理光譜的FSD變換結果將5號處理變換后的結果與對照葉片變換后的結果進行比較，結果如圖.7所示。2個圖譜的主要差別體現在3000 cm1及20001000 cm1范圍內，分別體現了不同種類物質在鎘脅迫期間代謝上的不同變化。圖.7 5號與對照的FT-IR圖譜的比較注：紅色代表對照，藍黑色代表5號處理 其中，3000 cm1處的變化主要反映了脂類物質的變化，對此區(qū)域進行放大分析（圖.8），結果表明2種處理導致葉片在此區(qū)域內FSD光譜有明顯變化，表現為峰的位置有漂移，峰的數量也有所變化?？偟膩碚f，3號處理的光譜特征更近似于對照葉片，而5號處理的光譜特征與對照差別

32、較大。5號處理的光譜特征在峰的位置上與3號處理類似，但是各峰的尖銳程度明顯減少，這種變化代表了什么樣的生理變化，尚不得而知。同時，這個區(qū)域的變化特征與其它區(qū)域也有類似規(guī)律。最左側的峰是CH3的ASY-STR震動，而隨后較高的峰是CH2的ASY-STR振動，從峰的積分面積來看，鎘處理葉片CH3/CH2比例增加，可能也表示甲基化程度的增加。而且3號處理的這種變化更加明顯。已經知道，鎘脅迫可以嚴重干擾膜脂代謝15，實驗結果也證實鎘脅迫確實改變了膜脂組成，且這種變化與脅迫時間有關。Absorbance 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2820 2840

33、2860 2880 2900 2920 2940 2960 2980 3000 Wavenumbers (cm-1) 圖.8 3000 cm1區(qū)域附近FSD光譜的變化注：紅色對照，藍黑色3號，靛色5號3.4 1700-900 cm1區(qū)域內FSD光譜的變化 在這個區(qū)域內，密集的分布著核酸、蛋白質和糖類物質的振動峰，彼此之間互相干擾，不容易分析22。利用FSD變換的方法，在本實驗中較好的對此區(qū)域進行了峰的區(qū)別（圖.9），結果表明5號處理和對照相比，在1740cm1區(qū)域的光譜數據有明顯區(qū)別，這個區(qū)域的振動主要來自細胞壁中的果膠酯鍵，5號處理在1740cm1區(qū)域的振動出現了一個小的側峰，而且積分面積顯

34、著小于對照葉片，可能是細胞壁的合成受到抑制所致14。 圖.9 5號與對照葉片在1740cm1區(qū)域FSD光譜的比較 注：藍色代表對照，紅色代表5號處理3.5 1650cm1區(qū)域FSD光譜的變化 在植物鎘脅迫研究中，一個重要的研究內容就是鎘對蛋白質結構的影響，由于FT-IR技術的先天優(yōu)勢，在研究總蛋白結構變化中具有重要價值。本實驗中，主要研究了amide I峰的變化規(guī)律。 圖.10 5號與對照葉片在1650cm1區(qū)域FSD光譜的比較注：紅色3號，藍黑色對照，靛色5號5號結果表明，amide I可以分為4個不同的峰，既1695.9，1655.6，1638.0和1626.7 cm1。其中在1695處出

35、現了一個相對較低的峰，在1627cm1處出現了一個相對較強的峰，這個峰是一個不常出現的峰，這種模式非常符合蛋白質結構在逆境條件下出現的構象變化理論，意味著出現了較多的折疊，取代了原來的a螺旋，代表了蛋白質結構明顯的變化23，因為16501658cm1代表a螺旋結構的振動，而16201640cm1代表折疊結構的振動22。理論研究和實驗證據表明，amide I峰的特征和蛋白質二級結構之間具有很好的一致性。因此，本實驗的結果表明，鎘處理導致植物葉片的總蛋白構象發(fā)生了深刻的變化，隨著處理時間的延長，這種變化會減弱。3.6對其它物質的含量的影響發(fā)現5號處理與對照葉片在1543 cm1附近的FSD光譜有顯

36、著差別（圖.11），表現為5號處理峰的尖銳程度下降，但是總面積高于對照。1543 cm1的振動峰代表了amide II峰，是肽鍵的振動，其面積可以代表總蛋白含量22。圖.11 5號與對照葉片在1540cm1區(qū)域FSD光譜的比較注：藍色對照，紅色5號在900-1250 cm1區(qū)域內，5號處理與對照相比，其FSD光譜也有明顯變化（圖.12）。對照葉片在1012.7 cm1處尋找到DNA的特異峰（圖.13），但是沒有發(fā)現RNA的振動峰，這是否是因為浸水導致RNA代謝異常所致尚待研究。對照1041.3 cm1代表了糖類物質的振動23，而5號處理糖峰漂移到1047.9 cm1，可能暗示了不同的糖類組成。

37、圖.12 5號與對照葉片在1000cm1區(qū)域FSD光譜的比較注：紅色3號，藍黑色對照，靛色5號1圖.13 對照光譜DNA峰的識別4討論綜合本實驗中得到的紅外光譜數據，發(fā)現鎘處理嚴重影響了葉片的紅外光譜特征，而且這種影響與處理條件相關。從總體上看，鎘處理導致在若干區(qū)域的振動峰均變得模糊，峰之間的差異減少，這是否因為代謝失調使物質代謝中間物積累，從而掩蓋了不同物質的差別尚待進一步研究。而且鎘處理 24h時葉片更接近與對照葉片的紅外光譜特征，這可能是24h處理時使葉片產生適應性所致，確實在其它研究中發(fā)現較長時間的處理有時會使植物對脅迫產生適應，從而對脅迫的敏感性下降。同時，本實驗中發(fā)現，鎘處理葉片在

38、1600cm1處左右的峰明顯高于對照，這可能是因為鎘抑制降解相關的酶而導致產物積累。本實驗證明，紅外光譜是一項靈敏的研究鎘對植物脅迫效應的實驗手段和思路，從可檢索的范圍內，沒有發(fā)現國內外有類似研究報導。參考文獻1 陳宏,徐秋曼,王葳.鎘對小麥幼苗脂質過氧化和保護酶活性的影響.西北植物學報,2000,20(3):399403.2 丁小余,施國新,常福辰.Cd2+污染對莼菜葉片形態(tài)學傷害反應的研究.西北植物學報,1998,18(3):417422.3 段昌群.植物對環(huán)境污染的適應與植物的微進化.生態(tài)學雜志,1995,14(5):4350.4 何篤修.用HPLC反相柱層析純化玉米根結合蛋白從玉米中提

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