千里光水浸液對大腸埃希菌R質(zhì)粒的消除作用

1、千里光水浸液對大腸埃希菌R質(zhì)粒的消除作用    【摘要】  目的探討千里光對大腸埃希菌R質(zhì)粒消除作用。方法對尿路感染患者尿液中分離的大腸埃希菌R質(zhì)粒進行檢測，并選用中藥千里光水浸液對該質(zhì)粒進行了體外、體內(nèi)消除實驗。體外實驗：千里光水浸液亞抑菌濃度分別作用大腸埃希菌24，48，72 h后，影印培養(yǎng)，計數(shù)消除子數(shù)；體內(nèi)實驗：建立腸道去污染小鼠動物模型后，經(jīng)口感染大腸埃希菌，同時給千里光水浸液，灌胃給藥，每只2 mg/d，分別于給藥后24 ，48，72 h后處死小鼠，分離培養(yǎng)細(xì)菌，計數(shù)消除子數(shù)。消除子經(jīng)質(zhì)粒抽提瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果體外藥物作用24

2、，48，72 h后，R質(zhì)較消除率分別為：0.2%，2.2%，3.8 %；SDS對照組分別為12.1%，14.9%，23.7%，體內(nèi)藥物作用24，48，72 h R質(zhì)粒消除率分別為0%，3.1%，14.4%，對照組分別為0%，0.1 %，0.1%。結(jié)論中藥千里光水浸液對大腸埃希菌R質(zhì)粒于體內(nèi)、體外均具有消除作用，體內(nèi)消除作用強于體外。 【關(guān)鍵詞】  千里光 大腸埃希菌 R質(zhì)粒 消除Abstract:ObjectiveTo explore the elimination effect of Senecio scandens Buch-Ham (SSB) Liquid Extracts o

3、n R plasmid (RP) of Escherichia coilMethodsRP of E.coil were isolated from the urine of urinary tract infection patients, and the elimination test of SSB extracts on these plasmids was performed in vitro and in vivo. After sub-bacteriostatic concentration of SSB extracts treated E.coil in vitro for

4、24 h, 48h and 72h. Replica plating and counting of colonies resisting to antibiotics were carried out. Germ-free mice in intestine were orally inoculated with E.coil, then water decoct agent of SSB was given orally in 2 mg/d per mouse, Eliminant of E.coil was identified by replica plating and colony

5、 counting after 24 h, 48h and 72 h, respectivelyRP eliminated bodies were identified through electrophoresis with agarose gel. ResultsAfter drug acted on E.coil 24 h, 48h and 72h in vitro respectively, elimination rate of RP in SSB tested group were 0.2%, 2.2%, 3.8%, while in control SDS group were

6、12.1%, 14.9%, 23.7%，respectively; 24 h, 48h, 72h in vivo, elimination rate of RP in test group were 0, 3.1%, 14.4%, and in control group were 0, 0.1%, 0.1%, respectively.ConclusionSSB has strong function to eliminate RP of E.coil in vivo and in vitro. The eliminative effect is stronger in vivo than

7、in vitro.Key words:Senecio scandens Buch-Ham;   Escherichia coil;   R plasmids;   Elimination大腸埃希菌作為條件致病菌是醫(yī)院內(nèi)感染最常見病原菌之一，其耐藥菌株引起的感染日益增多。細(xì)菌的耐藥性由染色體或耐藥質(zhì)粒(R質(zhì)粒)介導(dǎo)，耐藥質(zhì)?？赏ㄟ^接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式在不同菌種之間傳遞，使敏感菌成為耐藥株，造成了R質(zhì)粒的流行1。影響R質(zhì)粒傳播的因素主要是由于抗生素的濫用，即抗生素的使用起到了選擇作用，使含有R質(zhì)粒的菌株得以生存、擴增。將R質(zhì)粒從宿主菌中

8、消除，使其恢復(fù)對抗生素的敏感性，是臨床治療多重耐藥菌感染的新思路2。用人工方法消除R質(zhì)粒國內(nèi)外曾有報道3。本實驗用中藥千里光水浸液作為消除劑，對大腸埃希菌R質(zhì)粒進行體內(nèi)、體外消除實驗，觀察千里光對耐藥質(zhì)粒的消除作用，探討其臨床應(yīng)用的可能性。1  材料1.1  菌株大腸埃希菌(E.coil)，從贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院尿路感染患者尿中分離并鑒定為大腸埃希菌。1.2  藥品與試劑千里光購于江西贛南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，取干燥生藥50 g，加適量水煮沸30 min，過濾，藥渣再加水煮沸30 min，過濾，合并兩次濾液，濃縮到50 ml，即得1 g/ml千里光水浸液。營養(yǎng)瓊

9、脂為上海醫(yī)學(xué)化驗所產(chǎn)品；LB肉湯培養(yǎng)基(每毫升中含蛋白胨1 g，酵母抽提物5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖1 g，pH7.2)；十二烷基硫酸鈉(SDS)購于華美生物工程公司；四環(huán)素（TC）、氨芐青霉素(AP)、鏈霉素(SM)均系國產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)品。1.3  動物昆明小鼠30只，68周齡，體重1820g，雌雄不限，由贛南醫(yī)學(xué)院實驗動物部提供。2  方法2.1  實驗菌耐藥性測定以平板稀釋法4測定各抗生素對大腸埃希菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)。2.2  體外消除實驗按文獻(xiàn)5方法進行。將大腸埃希菌接種于 LB

10、肉湯培養(yǎng)基中，37過夜振蕩培養(yǎng)，調(diào)菌液濃度1.5×109cfu/ml。取菌液5 l分別加入含不同濃度千里光(自100 mg/ml開始，倍比稀釋至第7管，第8管不加藥為空白對照管)的LB肉湯培養(yǎng)基中，每管LB培養(yǎng)基總量為1 ml。37振蕩培養(yǎng)24，48，72 h后取出，觀察細(xì)菌生長現(xiàn)象，判定亞抑菌濃度。從亞抑菌濃度管中取50 l菌液分別劃線接種于10塊4%瓊脂平板培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)24 h，待長出單個菌落后，挑取單個菌落1 000個，以影印培養(yǎng)法，依次轉(zhuǎn)接于含TC(20g/ml)，SM(40 g/ml)或AP(20 g/ml)的藥物平板上以及不含藥物的4%營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)

11、24 h，觀察并記錄結(jié)果。挑取在無藥平板上生長而在含藥物平板不長的菌落，即初步確定為R質(zhì)粒消除子，再經(jīng)相同抗菌藥物平板復(fù)試以后，最后確定為R質(zhì)粒消除子。將搜集到的消除子與原菌液同時按文獻(xiàn)6快速抽提質(zhì)粒DNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測質(zhì)粒帶的消失情況。另設(shè)SDS陽性對照組和空白對照組，消除實驗方法同上。2.3  體內(nèi)消除實驗 2.4  統(tǒng)計學(xué)分析各組實驗數(shù)據(jù)釆用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理，進行采用2 檢驗。3  結(jié)果3.1  大腸埃希菌對抗生素耐藥性檢測結(jié)果 TC，SM，AP對大腸埃希菌MIC均>800 g/ml，呈高度

12、耐藥，千里光對大腸埃希菌MIC為12.5 mg/ml。3.2  體外消除實驗 千里光體外作用大腸埃希菌24 h后，其消除結(jié)果與空白對照組比較，無明顯差異(P>0.05)；體外作用48 h與72 h后，其消除結(jié)果與空白對照組比較，有極顯著性差異(P<0.01)，表明千里光體外有消除大腸埃希菌R質(zhì)粒作用，但其消除作用低于SDS對照組(P<0.01) 。結(jié)果見表1。表1  千里光水浸液作用不同時間后對大腸埃希菌R質(zhì)粒體外消除的影響（略）3.3  體內(nèi)消除實驗 千里光體內(nèi)作用大腸埃希菌24h，其消除結(jié)果與對照組經(jīng)卡方檢驗P>0.05，無顯

13、著性差異； 48 h與72 h消除結(jié)果經(jīng)卡方檢驗P<0.01，有極顯著性差異，表明千里光體內(nèi)對大腸埃希菌R質(zhì)粒也有消除作用。結(jié)果見表2。表2  千里光水浸液作用不同時間后對大腸埃希菌R質(zhì)粒體內(nèi)消除的影響（略）3.4  消除R質(zhì)粒的表型千里光在小鼠體內(nèi)R質(zhì)粒的消除實驗中，試驗菌株的耐藥性可表現(xiàn)為單一或多重(二耐以上)耐藥性的丟失，而體外消除實驗和對照組R質(zhì)粒的丟失表現(xiàn)為單一耐藥性的丟失。3.5  消除子的質(zhì)粒檢測結(jié)果原始株與消除子經(jīng)堿裂解法快速抽提質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察發(fā)現(xiàn)消除子均都丟失1至數(shù)條質(zhì)粒帶，表明在千里光作用下，質(zhì)粒被消除。4  討

14、論質(zhì)粒編碼所產(chǎn)生的細(xì)菌耐藥性和毒力等問題，給人類疾病治療帶來了很大困難，腸道耐藥基因庫的存在是腸道致病性耐藥菌株流行的潛在危險。消除耐藥質(zhì)粒，使耐藥菌株恢復(fù)敏感性，對于治療臨床上由耐藥菌導(dǎo)致的感染和阻斷耐藥性和毒力的傳播都有非常重要的意義。質(zhì)粒具有自然丟失與人工消除的特性，但R質(zhì)粒自發(fā)消除很緩慢，其消除頻率為10-210-88。自20世紀(jì)60年代以來，人們發(fā)現(xiàn)各種理化因素均可消除R質(zhì)粒，如高溫培養(yǎng)、紫外線照射、電穿孔法、SDS、高溫SDS雙重處理、嗅化乙錠、丫啶橙等可影響R質(zhì)粒消除，抗生素也具有R質(zhì)粒消除作用3。R質(zhì)粒消除后細(xì)菌的耐藥性也隨之喪失，R質(zhì)粒與染色體突變不同，R質(zhì)粒消除后其耐藥性不

15、再恢復(fù)，除非外源R質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)入，但由于這些物理化學(xué)因素對人體均有較強的毒副作用，不便投入臨床應(yīng)用3。中藥屬于天然植物藥，毒副作用小，應(yīng)用安全。中藥的質(zhì)粒消除研究始于20世紀(jì)80年代，1983年徐建國等報道用黃連素消除去污染小鼠體內(nèi)痢疾桿菌的R因子；1985年陳小英2報道用大黃素消除金黃色葡萄球菌的耐藥質(zhì)粒，此后陸續(xù)有相關(guān)研究報道，但多為抗菌能力強的清熱解毒或清熱燥濕類中藥。本實驗選用的千里光為對大腸埃希菌具有較強抑制作用的清熱解毒類中藥，MIC為12.5 mg/ml，故選其作為消除劑。結(jié)果表明：千里光對大腸埃希菌R質(zhì)粒具有消除作用，且體內(nèi)消除作用強于體外，其可能原因是在體內(nèi)細(xì)菌不僅受到藥物的作

16、用，同時受到機體的內(nèi)環(huán)境，特別是免疫因素影響。R質(zhì)粒的消除不僅表現(xiàn)為單一耐藥性的丟失，還表現(xiàn)為多重耐藥性的丟失；消除R質(zhì)粒最佳時間為體外48 h(P<0.01)，體內(nèi)72 h (P<0.01)。中藥千里光在臨床上不但可用于體外，也可用于體內(nèi)，其抗菌能力的強弱與其對細(xì)菌質(zhì)粒消除率的大小之間是否存在相關(guān)性還不清楚，因此有關(guān)千里光水浸液對R質(zhì)粒的消除機制有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Mandic A, Ostojic N. The role and importance of plasmid resistance in certain pathogenic enterobacteria J.Med Pregl,1995,48(12)：437.2李萇清, 周岐新, 凌保東. 耐藥質(zhì)粒消除的研究概況與展望J. 川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2003,18(2): 168.3陳軍劍, 陳 群. 中藥對R質(zhì)粒消除作用的研究J.中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2003, 15(2)：120.4George M，Eliopoulos，Robert C，et a1Antimicrobial CombinationsM.Antibootics i