改進(jìn)的堿裂解法大規(guī)模提取質(zhì)粒DNA

1、改進(jìn)的堿裂解法大規(guī)模提取質(zhì)粒DNA         11-06-01 08:31:00     編輯：studa20                作者：王勇 袁華 劉國(guó)磊 袁玉林【摘要】  對(duì)質(zhì)粒的堿裂解小量提取法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)的方法克服了以往質(zhì)粒提取方法的RNA等雜質(zhì)污染、操作煩瑣費(fèi)時(shí)、一般條件下不能大規(guī)模提取等

2、問題，該方法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用且大規(guī)模提取，提取的質(zhì)粒DNA得率穩(wěn)定、質(zhì)量好，符合大多數(shù)分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)的要求。 【關(guān)鍵詞】  純化; 堿裂解; 質(zhì)粒DNA質(zhì)粒的提取作為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)基本操作技術(shù)，幾乎每天都要用到。盡管現(xiàn)在質(zhì)粒提取的試劑盒有很多，但是對(duì)于普通的實(shí)驗(yàn)室，特別是科研經(jīng)費(fèi)不夠充分以及實(shí)驗(yàn)條件不夠好的實(shí)驗(yàn)室，并不能實(shí)現(xiàn)每次都用試劑盒來大規(guī)模提取質(zhì)粒。所以，采用的還都是薩姆布魯克1所提出的經(jīng)典提取方法。本研究是在經(jīng)典的質(zhì)粒提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些改進(jìn)，能夠在簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模提取質(zhì)粒DNA，該方法還克服了以往提取質(zhì)粒方法的RNA等雜質(zhì)污染和操作煩瑣，且得到的質(zhì)粒D

3、NA的質(zhì)量和純度均符合實(shí)驗(yàn)的要求。1 材料和方法1.1 材料1(5192bp.Ampr帶有綠色熒光)和pGenesil3(4842bp.Ampr帶有紅色熒光)為靶向IGF1和EGF受體基因的小干擾RNA的真核表達(dá)重組質(zhì)粒由本室設(shè)計(jì)和晶賽公司構(gòu)建和鑒定。限制性內(nèi)切酶EcoR I 為Promega 公司產(chǎn)品;Sal I為NEW ENGLAND BioLabsinc產(chǎn)品;其他常規(guī)分裝分子生物學(xué)試劑均購于武漢天源生物技術(shù)公司。氨芐青霉素與卡那霉素購自華美生物工程公司;其它各種堂規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。溶液：10mmol/L TrisHCl,pH7.5,50mmol/L EDTA, pH8.0;滅菌后，加

4、入RNaseA至20ug/ml,4保存。溶液：1%SDS，0.2mol/L NaOH;現(xiàn)配現(xiàn)用，2%SDS，0.4mol/L NaOH母液等體積混均即可。溶液：與常規(guī)堿裂解法相同，1.32mol/L醋酸鉀，pH 4.8,用醋酸調(diào)節(jié)pH值。滅菌后，4保存。1.2 方法常規(guī)提取方法主要按文獻(xiàn)1進(jìn)行，但提取得到的質(zhì)粒DNA不用RNaseA消化。改進(jìn)的質(zhì)粒DNA大規(guī)模提取方法按如下步驟進(jìn)行： 挑單菌于帶有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37搖菌過夜，至OD值為0.6，取1.5mL 菌液1.5mL ependorf管中，12000g,離心30s，棄盡上清，再重復(fù)兩次，每個(gè)ependorf管共收集4.5m

5、L菌; 加入溶液600uL，漩渦振蕩器振蕩，振蕩使菌體充分分散，室溫放置5 min; 加入溶液600uL，輕輕顛倒ependorf管45次，使溶液充分混勻，置于冰上5 min; 加入溶液600uL，輕輕顛倒ependorf管45次，使溶液充分混勻，置于冰上15min; 12000g,4,離心15min;吸出上清，加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕顛倒振蕩，充分混勻; 12000g，室溫，離心15min;棄盡上清，加入70%的乙醇洗滌沉淀一次; 超凈工作臺(tái)吹干沉淀或真空干燥，加入75uL無菌水，溶解沉淀。GW)法2。樣品釋稀20倍后，分別測(cè)定OD260和OD280值，若OD260/OD280>

6、1.8,表明DNA中含有RNA雜質(zhì)。若OD260/OD280<1.6，表明樣品中含有酚或蛋白質(zhì);OD260=0.1時(shí)，相當(dāng)50ug/mL的DNA。2 結(jié)果與分析2.1 質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中采用4842bp和5192bp的小質(zhì)粒pGenesil1和pGenesil3的小質(zhì)粒來檢測(cè)改進(jìn)的質(zhì)粒提取方法的重復(fù)性和適用性。從圖1可以看出，改進(jìn)質(zhì)粒提取方法的得率達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的常規(guī)方法，且質(zhì)粒DNA質(zhì)量好，主要以超螺旋形存在;質(zhì)粒DNA雜質(zhì)明顯少于常規(guī)方法所提取的質(zhì)粒;最主要的是在小提取質(zhì)粒條件下，使用N個(gè)ependorf管可以一次性大規(guī)模提取質(zhì)粒DNA;這種改進(jìn)的方法同樣可以適用大質(zhì)粒的提取，并且

7、得率比常規(guī)方法略高，解決了分子量大的質(zhì)粒難以提取的難題。2.2 質(zhì)粒DNA的定量及雜質(zhì)檢測(cè)采用常規(guī)與改進(jìn)的堿裂解法提取的pGenecil1和pGenesil3質(zhì)粒DNA，經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)可知，改進(jìn)方法提取質(zhì)粒pGenecil1和pGenesil3的得率到達(dá)常規(guī)方法的水平，對(duì)于大質(zhì)粒改進(jìn)方法的得率更高，是常規(guī)方法的1.2倍。但是常規(guī)的堿裂解法提取未經(jīng)RNaseA消化，質(zhì)粒DNA的OD260/OD280比值明顯增高者，表明RNA雜質(zhì)明顯減少(表1)。表1 不同方法所制備的質(zhì)粒的質(zhì)量及含量1: DNA Markers;2:來自隨機(jī)1個(gè)菌落改進(jìn)方法提取的pGenesil1;35:來自隨機(jī)3個(gè)菌落改進(jìn)方

8、法提取的pGenesil3;6:來自隨機(jī)1個(gè)菌落常規(guī)方法提取的pGenesil1;79:來自隨機(jī)3個(gè)菌落常規(guī)方法提取的pGenesil3。圖1 質(zhì)粒DNA 的電泳檢測(cè)3 討論質(zhì)粒大規(guī)模提取早期研究工作中的實(shí)驗(yàn)室水平和制備及設(shè)備工藝要求高大。本研究在經(jīng)典的堿裂解小提取質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，使堿裂解菌液過程在N個(gè)ependorf管中完成。過去大多數(shù)質(zhì)粒提取方法都是在最后的質(zhì)粒DNA樣品中加入RNaseA,以除去RNA雜質(zhì)3，4，而本法直接將RNasA加入溶液中，在質(zhì)粒的提取過程中進(jìn)行RNA的消化，從而避免了常規(guī)方法在最后的質(zhì)粒DNA中加入RNaseA,給樣品帶來人為蛋白污染;也保證了對(duì)所有樣品裂

9、解的均質(zhì)性。從而使不同批次提取的質(zhì)粒具有相同的質(zhì)量。由于大腸桿菌不同菌株自身的特點(diǎn)，相同的提取方法提取的質(zhì)粒會(huì)有所不同。不同的大腸桿菌細(xì)胞株會(huì)影響質(zhì)粒的產(chǎn)量，也會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量或拓?fù)渚恍?，在?xì)菌培養(yǎng)的過程中，由于Amp篩選壓力的逐漸消失,不同菌株在保有質(zhì)粒的性能上會(huì)有所差別，質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)丟失現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中選擇的挑單菌于帶有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，菌株在質(zhì)粒保有率上是最好的，也比較適合堿裂解提取質(zhì)粒的方法，從質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖1和OD260/OD280可以看出，在溶液預(yù)先加入RNaseA可以起到很好消化RNA雜質(zhì)的作用，因而節(jié)省了RNaseA消化樣品的時(shí)間，提高了提取效率。改進(jìn)

10、的方法還省去了苯酚和氯仿抽提過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所得樣品純度與常規(guī)方法所得樣品純度相近，節(jié)省了試劑與提取時(shí)間，整個(gè)提取過程不到1h。采用改進(jìn)方法提取的質(zhì)粒DNA干燥后，風(fēng)干沉淀物有時(shí)可能產(chǎn)生不溶現(xiàn)象，依據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)，將沉淀物充分搗碎使其中DNA充分溶解，再離心，取上清。這不會(huì)造成質(zhì)粒DNA的損失，也不會(huì)影響下游的實(shí)驗(yàn)。最重要是在小提取質(zhì)粒條件下一次性可以大規(guī)模提取質(zhì)粒DNA，達(dá)到了經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)易、快速、效益和質(zhì)量高的效果。因此文中改進(jìn)提取質(zhì)粒的方法快捷、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。在我們的研究中，都是采用這種改進(jìn)方法提取質(zhì)粒DNA，其下游的內(nèi)切酶消化、克隆、PCR、重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定、轉(zhuǎn)化大腸桿菌和根瘤農(nóng)桿菌等實(shí)驗(yàn)的

11、結(jié)果和重復(fù)性都令人滿意?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1J薩姆布魯克, D W 拉塞爾. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.黃培堂，譯.北京：科學(xué)出版社, 2005.2 F M 奧斯伯(美).精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第5版).北京：科學(xué)出版社, 2008.3 義華，徐梅珍，于學(xué)平，等. 質(zhì)粒DNA堿裂解提取法的改進(jìn). 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2002,24(6):85153.4 姚偉,周會(huì), 徐景升, 等. 質(zhì)粒DNA小量提取法的改進(jìn).應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2005，11(6)：776778     11-06-01 08:31:00   

12、0; 編輯：studa202 結(jié)果與分析2.1 質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中采用4842bp和5192bp的小質(zhì)粒pGenesil1和pGenesil3的小質(zhì)粒來檢測(cè)改進(jìn)的質(zhì)粒提取方法的重復(fù)性和適用性。從圖1可以看出，改進(jìn)質(zhì)粒提取方法的得率達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的常規(guī)方法，且質(zhì)粒DNA質(zhì)量好，主要以超螺旋形存在;質(zhì)粒DNA雜質(zhì)明顯少于常規(guī)方法所提取的質(zhì)粒;最主要的是在小提取質(zhì)粒條件下，使用N個(gè)ependorf管可以一次性大規(guī)模提取質(zhì)粒DNA;這種改進(jìn)的方法同樣可以適用大質(zhì)粒的提取，并且得率比常規(guī)方法略高，解決了分子量大的質(zhì)粒難以提取的難題。2.2 質(zhì)粒DNA的定量及雜質(zhì)檢測(cè)采用常規(guī)與改進(jìn)的堿裂解法提

13、取的pGenecil1和pGenesil3質(zhì)粒DNA，經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)可知，改進(jìn)方法提取質(zhì)粒pGenecil1和pGenesil3的得率到達(dá)常規(guī)方法的水平，對(duì)于大質(zhì)粒改進(jìn)方法的得率更高，是常規(guī)方法的1.2倍。但是常規(guī)的堿裂解法提取未經(jīng)RNaseA消化，質(zhì)粒DNA的OD260/OD280比值明顯增高者，表明RNA雜質(zhì)明顯減少(表1)。表1 不同方法所制備的質(zhì)粒的質(zhì)量及含量1: DNA Markers;2:來自隨機(jī)1個(gè)菌落改進(jìn)方法提取的pGenesil1;35:來自隨機(jī)3個(gè)菌落改進(jìn)方法提取的pGenesil3;6:來自隨機(jī)1個(gè)菌落常規(guī)方法提取的pGenesil1;79:來自隨機(jī)3個(gè)菌落常規(guī)方法提取

14、的pGenesil3。圖1 質(zhì)粒DNA 的電泳檢測(cè)3 討論質(zhì)粒大規(guī)模提取早期研究工作中的實(shí)驗(yàn)室水平和制備及設(shè)備工藝要求高大。本研究在經(jīng)典的堿裂解小提取質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，使堿裂解菌液過程在N個(gè)ependorf管中完成。過去大多數(shù)質(zhì)粒提取方法都是在最后的質(zhì)粒DNA樣品中加入RNaseA,以除去RNA雜質(zhì)3，4，而本法直接將RNasA加入溶液中，在質(zhì)粒的提取過程中進(jìn)行RNA的消化，從而避免了常規(guī)方法在最后的質(zhì)粒DNA中加入RNaseA,給樣品帶來人為蛋白污染;也保證了對(duì)所有樣品裂解的均質(zhì)性。從而使不同批次提取的質(zhì)粒具有相同的質(zhì)量。由于大腸桿菌不同菌株自身的特點(diǎn)，相同的提取方法提取的質(zhì)粒會(huì)有所不

15、同。不同的大腸桿菌細(xì)胞株會(huì)影響質(zhì)粒的產(chǎn)量，也會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量或拓?fù)渚恍裕诩?xì)菌培養(yǎng)的過程中，由于Amp篩選壓力的逐漸消失,不同菌株在保有質(zhì)粒的性能上會(huì)有所差別，質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)丟失現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中選擇的挑單菌于帶有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，菌株在質(zhì)粒保有率上是最好的，也比較適合堿裂解提取質(zhì)粒的方法，從質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖1和OD260/OD280可以看出，在溶液預(yù)先加入RNaseA可以起到很好消化RNA雜質(zhì)的作用，因而節(jié)省了RNaseA消化樣品的時(shí)間，提高了提取效率。改進(jìn)的方法還省去了苯酚和氯仿抽提過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所得樣品純度與常規(guī)方法所得樣品純度相近，節(jié)省了試劑與提取時(shí)間，整個(gè)提取過程不到1h。采用改進(jìn)方法提取的質(zhì)粒DNA干燥后，風(fēng)干沉淀物有時(shí)可能產(chǎn)生不溶現(xiàn)象，依據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)，將沉淀物充分搗碎使其中DNA充分溶解，再離心，取上清。這不會(huì)造成質(zhì)粒DNA的損失，也不會(huì)影響下游的實(shí)驗(yàn)。最重要是在小提取質(zhì)粒條件下一次性可以大規(guī)模提取質(zhì)粒DNA，達(dá)到了經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)易、快速、效益和質(zhì)量高的效果。因此文中改進(jìn)提取質(zhì)粒的方法快捷、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。在我們的研究中，都是采用這種改進(jìn)方法提取質(zhì)粒DNA，其下游的內(nèi)切酶消化、克隆、PCR、重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定、轉(zhuǎn)化大腸桿菌和根