天然腦活素促細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞衰老作用的研究

1、天然腦活素促細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞衰老作用的研究    【摘要】  目的：探討天然腦活素對人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞（MRC-5）增殖能力和復(fù)制性衰老的影響及其機(jī)理。方 法： 光鏡下觀察 MRC-5 細(xì)胞衰老表型，常規(guī)計(jì)數(shù)細(xì)胞代齡、傳代速度， MTT 法檢測細(xì)胞增殖活度，X-Gal 染色法觀察細(xì)胞衰老情況，計(jì)數(shù)衰老細(xì)胞百分率。 結(jié)果：天然腦活素可維持細(xì)胞的非衰老表型，增加 MRC-5 細(xì)胞代齡，天然腦活素 孵育 MRC-5&#

2、160;細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力較空白老齡對照組明顯升高（P  0.05），細(xì)胞的增殖速度顯著加快。另外，天然腦活素連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞在老齡階段衰老細(xì)胞數(shù)顯著低于老齡對照細(xì)胞（P  0.01）。 結(jié)論：天然腦活素可升高 MRC-5 細(xì)胞增殖能力，有效延緩細(xì)胞的復(fù)制性衰老?！娟P(guān)鍵詞】  天然腦活素； 人胚肺成纖維細(xì)胞；增殖活度；復(fù)制性衰老；延緩    Abstract    Objective   

3、  To  explore  the  effects  of  Natural  Cerebrolysin  on  cell  proliferation  activity  and replicative  senescence  of  human  embr

4、yonic  lung  diploid  fibroblasts  (MRC-5  cells)  and  its  mechanism.  Methods     To  observe  the  changes  of  senescent 

5、0;phenotype  by  light  microscope,  count  the  passage ages  and  velocity,  detect  the  potential  of  cell  proliferation  by  MTT

6、.  The  changes  of  cells  senescence of  Natural  Cerebrolysin-effected  MRC-5  cells  were  studied  by  X-Gal  staining  method,  a

7、nd  the  positivecell  rates  of  senescence  cells  were  detected  and  analyzed.   Results      Natural  Cerebrolysin  maintaineduna

8、ltered  cell  morphology  and  increased  life  span  of  MRC-5  by  at  least  18-21  passages.  Comparing  withthe  control  sen

9、ium  cells,  the  proliferation  potential  of  MRC-5  cells  incubated  with  Natural  Cerebrolysin was  increased  obviously  (P  < 

10、60;0.05),  and  the  passage  velocity  was  enhanced  double  of  that  of  the  controlsenium  cells  (P  <  0.01).  In 

11、 addition,  the  positive  cell  rate  of  senescence  cells  was  significantly  lower  in late  passage  cells  in  sequenced  m

12、ultigeneration  culture  in  Natural  Cerebrolysin  than  those  of  control  senium cells  (P  <  0.01),  and  similar  to  those&#

13、160; of  young  cells.    Conclusion     As  a  result,  we  concluded  that  Natural  Cerebrolysin  could  notably  promote 

14、 the  proliferation  activity  of  MRC-5  cells  and  delay  the  cells  replicative  senescence  efficiently.    Key  Words   

15、60;Natural  Cerebrolysin;  Human  embryonic  lung  diploid  fibroblasts;  Proliferation  activity;  Delay;   Replicative  senescence    衰老（senescence）是細(xì)胞的重要生命現(xiàn)象之一，絕大

16、多數(shù)正常細(xì)胞被認(rèn)為僅有有限的分裂能力，當(dāng)其經(jīng)過一定的倍增之后，將進(jìn)入終末增殖狀態(tài)，稱為細(xì)胞衰老。一般來講，人類胚胎的成纖維細(xì)胞在達(dá)到衰老時，能夠復(fù)制 50 代左右（Population Doublings, Pds），由于這種衰老是由分裂傳代而達(dá)到的，故又稱之為復(fù)制性衰老（replicative senescence）1。探討細(xì)胞衰老的分子機(jī)理是人類認(rèn)識自我研究的重要組成部分，從分子水平研究衰老過程中基因及調(diào)控變化，已成為目前衰老機(jī)理研究的主要方向，同時研究開發(fā)延緩衰老的藥物將為提高人類生存質(zhì)量提供重要保證，也為衰老相關(guān)疾病的防治提供理論基礎(chǔ)和

17、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。    天然腦活素為結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)代藥效學(xué)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化篩選而成，本研究在以往基礎(chǔ)上以人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞（MRC-5）為研究對象，觀察了天然腦活素對 MRC-5 細(xì)胞表型、細(xì)胞代齡、傳代速度、細(xì)胞生長增殖能力及衰老相關(guān)指標(biāo)的影響，旨在探討其延緩 MRC-5 細(xì)胞復(fù)制性衰老的作用及其機(jī)理。    1    材料與方法    1.1    材料&#

18、160;   新西蘭家兔，雄性，體重（1.5±0.2）kg，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，經(jīng) 1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)之后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。    胎牛血清、EMEM 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司。MTT 購自 Sigma 公司。- 半乳糖苷酶細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒購自美國 KPL 公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。    1.2    方法&#

19、160;   細(xì)胞總傳代次數(shù)按 log 2（ D/Do/R）計(jì)算，D、Do 分別為收獲和接種時的細(xì)胞密度，R 為細(xì)胞貼壁率； 細(xì)胞平均傳代速度按公式（傳代次數(shù)-28）/周數(shù)計(jì)算，細(xì)胞傳代后如 3 周內(nèi)不能融合，定義為細(xì)胞復(fù)制性衰老終末。    1.3    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    實(shí)驗(yàn)結(jié)果以數(shù)據(jù)和圖表表示，測定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用

20、0;SPSS 8.0 軟件包分析，兩組比較采用 student t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以 P < 0.0 5 為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。2    結(jié)    果    2.1    天然腦活素對細(xì)胞表型的影響    由圖 1 可見，年輕組細(xì)胞呈梭性或長梭形，

21、核仁清晰，胞漿折光性強(qiáng)，細(xì)胞融合速度快，細(xì)胞排列整齊有序；復(fù)制性衰老細(xì)胞形態(tài)變異，胞體扁平寬大不規(guī)則，核仁不明顯，細(xì)胞排列凌亂無序，胞漿內(nèi)顆粒累積，出現(xiàn)空泡，細(xì)胞融合速度減慢；天然腦活素處理組細(xì)胞老齡化程度不明顯，細(xì)胞形態(tài)變化不大，而與年輕細(xì)胞相似。將已經(jīng)出現(xiàn)衰老表型的老齡細(xì)胞轉(zhuǎn)入含天然腦活素的 EMEM  中繼續(xù)培養(yǎng) 2472 h，細(xì)胞的衰老表型出現(xiàn)一定程度的改善，但未見完全逆轉(zhuǎn)。    2.2    天然腦活素對 MRC-5 細(xì)胞代齡和傳代速

22、度的影響    含天然腦活素血清的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng) MRC-5 細(xì)胞，與用含同體積空白對照血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)的 MRC-5 細(xì)胞進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然腦活素低、中、高劑量組細(xì)胞的代齡顯著高于空白老齡對照組細(xì)胞。天然腦活素培養(yǎng)的細(xì)胞傳代速度亦明顯快于老齡對照細(xì)胞（見表 1）。    2.3    天然腦活素對細(xì)胞增殖活度（MTT 值）的影響    分別用空白對照血清和天然腦活素血清培

23、養(yǎng)第 50 代 MRC-5 細(xì)胞 48 h 后，應(yīng)用 MTT 法檢測細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然腦活素培養(yǎng)的細(xì)胞增殖活度明顯高于空白老齡對照組細(xì)胞（P < 0.05），且隨濃度增加而升高；與年輕細(xì)胞無顯著性差異（P > 0.05） 。 提示，天然腦活素可促進(jìn) MRC-5 細(xì)胞的生長增殖（見表 2）。    2.4    天然腦

24、活素對 MRC-5 細(xì)胞衰老細(xì)胞數(shù)目的影響    天然腦活素作用于衰老成纖維細(xì)胞一定時間，固定后用 X-gal 染色檢測其 - 半乳糖苷酶活性。 SA- 半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞的胞漿染為青綠色，空白老齡對照組細(xì)胞 SA- 半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于年輕組細(xì)胞，而天然腦活素處理細(xì)胞組陽性細(xì)胞數(shù)較空白老齡對照組顯著降低（P < 0.01），見表 2。提示，天然腦活素可下調(diào) MRC-5  細(xì)

25、胞 SA-半乳糖苷酶的表達(dá)，抑制細(xì)胞衰老，延長細(xì)胞壽命。    3    討    論    絕大多數(shù)正常人類細(xì)胞在體外組織培養(yǎng)的序列傳代過程中，逐漸喪失其增殖傳代的能力，最終達(dá)到一種不可逆的增殖停滯狀態(tài)，并可保持代謝活力的穩(wěn)定，能夠維持?jǐn)?shù)月甚至數(shù)年。這種似乎是無限期的增殖停滯狀態(tài)被命名為衰老（senescence），而細(xì)胞達(dá)到衰老狀態(tài)時的傳代次數(shù)稱為壽限1，2。衰老是由細(xì)胞所經(jīng)歷的傳代次數(shù)決定的，而與時間無關(guān)。體外細(xì)胞的衰老

26、與體內(nèi)組織的衰老有直接的相關(guān)性3，4    人二倍體成纖維細(xì)胞（human diploid fibroblasts, HDFs）一般沒有端粒酶活性，所以當(dāng)端粒 DNA 長度丟失達(dá)到臨界長度時，染色體變形急劇增加，染色體間發(fā)生融合， 細(xì)胞不再增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡5，故常常被作為衰老研究的理想模型。衰老細(xì)胞除了不能復(fù)制傳代之外，還表現(xiàn)出一系列生理學(xué)、形態(tài)學(xué)和多種分子生物學(xué)的改變，如形態(tài)大小不規(guī)則，胞漿內(nèi)顆粒性物質(zhì)累積，細(xì)胞排列散亂，培養(yǎng)基中多見細(xì)胞碎片，細(xì)胞失去融合能力、縫隙連接減少等6-8

27、。    筆者以在體外只能進(jìn)行有限次數(shù)分裂的人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）制備復(fù)制性衰老細(xì)胞模型，研究天然腦活素延緩衰老的作用及機(jī)理。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，天然腦活素培養(yǎng)的細(xì)胞在老年階段未見上述衰老表型，將已出現(xiàn)衰老樣改變的細(xì)胞轉(zhuǎn)入天然腦活素培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞的衰老表型出現(xiàn)一定程度的改善，但尚未見完全逆轉(zhuǎn)，上述結(jié)果提示：天然腦活素能夠維持 MRC-5 的非衰老表型。    細(xì)胞壽命常以體外培養(yǎng)時細(xì)胞傳代次數(shù)表示。本研究結(jié)果顯示，低劑量、中劑量、高劑量天然腦活素的 EMEM 培養(yǎng)的&#

28、160;MRC-5 細(xì)胞平均傳代次數(shù)，顯著高于老齡對照細(xì)胞；天然腦活素培養(yǎng)的 MRC-5 細(xì)胞傳代速度也快于老齡對照細(xì)胞。提示天然腦活素可顯著增加細(xì)胞壽命，其可能促進(jìn)了細(xì)胞的增殖速度，這一結(jié)論被 MTT 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。    天然腦活素作用于正常衰老型成纖維細(xì)胞，通過測定衰老細(xì)胞的百分比，與老齡對照組細(xì)胞相比衰老細(xì)胞數(shù)目明顯減少，衰老細(xì)胞百分比顯著降低，提示天然腦活素可延緩衰老細(xì)胞的群體死亡的發(fā)生，從而延長細(xì)胞的體外壽命。    總之，本研究通過對細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞

29、壽命、細(xì)胞增殖活度、衰老細(xì)胞百分比等指標(biāo)的研究，初步證實(shí)天然腦活素可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖速度，進(jìn)而延緩 MRC-5 細(xì)胞的復(fù)制性衰老，為中藥延緩衰老開辟了新的研究途徑。關(guān)于天然腦活素對端粒酶活性、細(xì)胞端區(qū)縮短速率、基因損傷與修復(fù)能力以及衰老主導(dǎo)基因的表達(dá)的影響，本室正在進(jìn)一步研究中?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Miller RA. The aging immune system: primer and prospectus J. Seience, 1996,&

30、#160;273:70-742Haflick L. The 1imited in vitro 1ifetime diploid cel1 strains J. Exp Cel1 Res, 1965, 37:614-6163Goldstein, S. Repicative senescence:the human fibroblast comes of ageJ. Science. 1990, 249:1129-11334Faragher RG, Kipling D. How might Repicative senescence contribute to human ageing?JBiossayse, 1998, 20(12): 985-9915 Figueroa R, Lindenmaier H, Herg