東北不同產(chǎn)地野生羅布麻葉總黃酮含量及抗氧化性比較

1、東北不同產(chǎn)地野生羅布麻葉總黃酮含量及抗氧化性比較                      作者：李慶華，魏春雁 ，黃九林，李建東  【摘要】   目的測(cè)定東北松嫩草原和遼河入海口野生羅布麻葉總黃酮和槲皮素含量，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行比較。方法超聲波輔助提取總黃酮，比色法和HPLC分別測(cè)定總黃酮和槲皮素含量，DPPH?和?OH清除法評(píng)價(jià)抗氧化活性。結(jié)果松嫩草原和遼河入海

2、口羅布麻葉總黃酮含量分別為10.59311.001mg?g-1，11.203mg?g-1；槲皮素含量分別為5.5075.753mg?g-1，5.218mg?g-1。松嫩草原羅布麻葉總黃酮抗氧化活性較強(qiáng)。結(jié)論遼河入?？诤退赡鄄菰吧_布麻葉總黃酮、槲皮素含量差異不顯著，松嫩草原野生羅布麻葉總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性。 【關(guān)鍵詞】   羅布麻葉； 總黃酮； 槲皮素； 抗氧化Abstract：ObjectiveTo determine the contents of total flavonoids and quercetin from leaves of Apocynum venetum

3、 collected from Songnen Grassland and Liao River mouth area respectively. ThEir antioxidant capacities were compared.MethodsUltrasonic extraction were applied to extract total flavonoids. A spectrophotometric method was used to measure total flavonoids, and content of quercetin was determined by HPL

4、C. The antioxidant capacities of the extracts of total flavonoids from leaves of Apocynum venetum towards free radical scavenging were evaluated by 1,1-diphenyl-2-icrylhydrazyl(DPPH) and hydroxyl radicals.ResultsThe results showed that leaves of Apocynum venetum collected in Songnen Grassland and Li

5、ao River mouth area (10.593-11.001 mg?g-1 and 11.203 mg?g-1 respectively) both possessed higher amounts of flavonoids and the contents of quercetin from thEIrs were of 5.507-5.753 mg?g-1 and 5.218 mg?g-1 respectively. In addition, leaves of Apocynum venetum wildly growing in Songnen Grassland showed

6、 higher antioxidant activity as compared to that of Liao River mouth area. ConclusionThere is no significant difference in the contents of total flavonoids and quercetin from leaves of Apocynum venetum between both areas, however, leaves of Apocynum venetum wildly growing in Songnen Grassland show h

7、igher antioxidant activity as compared to Liao River mouth area, further study of the correlation between antioxidant capacity and the ratio of the content of quercetin to total flavonoids is required.Key words：  Apocynum venetum; Total flavonoids; Quercetin; Antioxidant ability  

8、0; 心腦血管疾病、癌變、衰老以及各種退行性疾病的發(fā)生和 發(fā)展 都與自由基在體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多，同時(shí)機(jī)體對(duì)自由基的防御能力不足有密切關(guān)系1。外源性抗氧化劑可以提高人體的抗氧化能力，清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，黃酮類化合物是一類天然抗氧化劑，具有高效低毒的特點(diǎn)。羅布麻Apocynum venetum L.為夾竹桃科植物，葉含有金絲桃苷、異槲皮素、槲皮素-3-O-槐糖苷、蕓香苷、槲皮素等多種黃酮成分。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了東北松嫩草原和遼河入?？谔幰吧_布麻葉總黃酮和槲皮素含量，并比較了其抗氧化活性，為更好的開(kāi)發(fā)利用羅布麻資源提供 參考 。 1  儀器與試藥 1.1  儀器LC10ATvp高效液相色

9、譜儀（日本島津）：雙泵、柱溫箱、SPD-10Avp檢測(cè)器、SIL-10ADvp自動(dòng)加樣器、CLASS-VP色譜工作站；UV-2201紫外分光光度計(jì)（日本島津）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。1.2  藥品1,1-二苯基苦基苯阱（DPPH?）和2-脫氧核糖購(gòu)于西格瑪公司上海辦事處；槲皮素和蘆丁購(gòu)于 中國(guó) 藥品生物制品檢定所；除用于HPLC的乙醇和甲醇為色譜純外，其余的藥品和試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3  材料2006-08-30分別采集于遼河入?？诘谋P(pán)錦和松嫩草原長(zhǎng)嶺縣的綠源草場(chǎng)、種馬場(chǎng)（松嫩草原生境變化較大，分別在草甸和輕鹽堿化草甸設(shè)兩個(gè)采樣點(diǎn)），樣品經(jīng)東北

10、師范大學(xué)草地 科學(xué) 研究所植被生態(tài) 教育 部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李建東教授和李志堅(jiān)副教授共同鑒定。 2  方法 2.1  超聲波輔助法提取總黃酮鮮樣用自來(lái)水沖凈后于60恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，干燥的樣品用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)1.2 mm的篩子。     取粉碎樣品5.0 g，加無(wú)水甲醇150 ml，室溫下超聲波輔助提取30 min，過(guò)濾。濾渣重新加無(wú)水甲醇150 ml，相同條件下再提取一次。合并兩次提取液，40減壓蒸干。用50的乙醇重新溶解，去除葉綠素，濾液用50乙醇定容至50 ml，搖勻，作供試樣品液備用。每個(gè)樣品依上述條件重復(fù)3次。2.2&#

11、160; 比色法測(cè)定總黃酮含量總黃酮含量的測(cè)定用改進(jìn)的Dowd方法2。精密稱取在120干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品，配制濃度依次為0，10，20，30，40，50，60 mg?L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)溶液3.0 ml，加入同體積2% AlCl3甲醇溶液，室溫下反應(yīng)15 min，415 nm測(cè)定吸收值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出方程Y=0.011 3X+0.003 8，R2=0.999，線性范圍為060 mg?L-1。 精密吸取上述供試品溶液3 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，于415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算 含量。樣品中總黃酮含量表達(dá)為羅布麻葉每克干重中蘆丁等價(jià)物的含量(mg RE?qg-1

12、 FM)表示，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。2.3  HPLC測(cè)定槲皮素含量色譜條件：ODS-C18色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-乙醇-水（48457）；流速：0.8 ml?min-1；進(jìn)樣量：20l；柱溫：25；檢測(cè)波長(zhǎng)：370nm3。HPLC圖見(jiàn)圖1。     配制濃度為0，25，50，75，100 g?ml-1槲皮素甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，依據(jù)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，槲皮素進(jìn)樣量（g）為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y=69953X-3 449.4，R2=1.000。槲皮素對(duì)照品在0.520 g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。    

13、 前述總黃酮提取液稀釋至合適比例后經(jīng)0.45m濾膜過(guò)濾后的濾液用于測(cè)定槲皮素含量，自動(dòng)加樣器精密吸取供試液20l注入高效液相色譜儀，按前述色譜條件測(cè)定，樣品中槲皮素含量由回歸方程得出。樣品中槲皮素含量表達(dá)為羅布麻葉每克干重中含有多少毫克槲皮素（mg QE?qg-1 FM），每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。2.4  DPPH?自由基清除活性測(cè)定方法配制濃度為0.1mol ?L-1的DPPH?甲醇溶液，1 ml提取液中加入2 ml的DPPH?溶液，室溫下反應(yīng)30min后用紫外分光光度計(jì)于517 nm處測(cè)定吸光值。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。抑制率計(jì)算公式：    

14、 抑制率（%）=(C-CB)-(S-SB)(C-CB)×100%C為標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值；CB為空白液的吸光度值；S為樣品反應(yīng)液的吸光度值；SB為對(duì)照液的吸光度值。2.5 ?OH清除活性測(cè)定方法?OH清除活性的測(cè)定采用輕微改進(jìn)的2脫氧核糖氧化法。反應(yīng)混合試劑包括5mmol? L-1 FeSO4，5mmol ?L-1 EDTA和5mmol ?L-1 2-脫氧核糖各0.2 ml，與0.2 ml提取液混合，加入0.1mol? L-1磷酸鹽緩沖液(pH7.4)1.0 ml后，再加入0.2 ml的5mmol ?L-1 H2O2，37保溫4 h后，加1.4%三氯乙酸、0.5%硫代巴比妥酸各1 ml。

15、反應(yīng)混合物放到沸水浴中煮沸10 min。532 nm處測(cè)吸光值。每個(gè)樣品平行測(cè)3次。抑制率的計(jì)算公式：     抑制率(%)=(C-CB)-(S-SB)(C-CB)×100%C為標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值；CB為空白液的吸光度值；S為樣品反應(yīng)液的吸光度值；SB為對(duì)照液的吸光度值。 3  結(jié)果與分析 3.1  黃酮類化合物含量測(cè)定結(jié)果羅布麻生態(tài)適應(yīng)能力強(qiáng)，分布廣泛，生境差異較大，有效成分的積累與氣候、土壤和降雨量等生態(tài)環(huán)境因素有關(guān)，與采收期也密切相關(guān)。從表1可見(jiàn)，遼河入?？诤退赡鄄菰吧_布麻葉總黃酮和槲皮素含量均較高。槲皮素在總黃酮中

16、的比率松嫩草原顯著高于遼河入?？谔?。表1  東北不同產(chǎn)地野生羅布麻葉總黃酮和槲皮素含量（略）3.2  抗氧化活性測(cè)定結(jié)果     DPPH?是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，由于其在可見(jiàn)光區(qū)有特征吸收峰，對(duì)DPPH?的淬滅能力可以有效地評(píng)價(jià)抗氧化劑的活性。羥自由基是最活潑，對(duì)機(jī)體危害最大的自由基。     各樣品對(duì)DPPH?和?OH的抑制率折合計(jì)算為IC50值（不加樣品的反應(yīng)體系的清除率設(shè)為0%，清除50%DPPH?或?OH時(shí)抗氧化劑的濃度為此樣品的IC50值）。用IC50顯示不同樣品清除DPPH?或

17、?OH的能力，IC50值越小，樣品對(duì)DPPH?或?OH清除能力越強(qiáng)。     從圖2可見(jiàn)，松嫩草原野生羅布麻葉總黃酮對(duì)DPPH?的清除活性略高于遼河入?？谔?，對(duì)?OH的清除活性顯著高于遼河入?？谔幍囊吧_布麻葉。 4  討論      東北松嫩草原和遼河入?？谔幰吧_布麻葉總黃酮和槲皮素含量均較高，并具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為提取用于藥品、食品領(lǐng)域高效能天然抗氧化劑的潛在資源。羅布麻葉本身含有一定量的槲皮素，其主要的黃酮類化合物如金絲桃苷、異槲皮苷等均是以槲皮素為苷元的，水解后測(cè)定的槲皮素含量為槲皮素的總量，松嫩草原野生羅布麻葉總黃酮和槲皮素含量與黃河入?？谔幉町惒伙@著，卻具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是否與槲皮素在總黃酮中較高比率有關(guān)，有待深入研究。 【 參考 文獻(xiàn) 】   1鄭榮梁，黃中洋.自由基生物學(xué)，第3版M.北京：高