乙肝五項的影響因素與技術(shù)分析分享

1、真誠為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請指正。河南科技大學(xué)高等教育自學(xué)考試畢業(yè)論文 題 目 ELISA方法檢測乙肝五項的結(jié) 果影響因素分析 地 市 學(xué) 校 商丘市高等醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校 專 業(yè) 醫(yī)學(xué)檢驗 準考證號 140113101163 考生姓名 申蒙蒙 指導(dǎo)教師 二一四年九月八日- 14 - / 17目 錄摘 要11前 言21.1乙肝表面抗原（HBsAg）21.2 乙肝表面抗體（HBsAb）21.3 乙肝抗原（HBeAg）31.4 乙肝E抗體（HBeAb）31.5乙肝核心抗體（HbcAb）42影響因素42.1 樣本采集與處理的影響42.2 試劑的影響53 操作技術(shù)的影響64 檢測結(jié)果研讀的影響

2、75 HooK效應(yīng)影響76 干擾物質(zhì)的影響87 藥物的影響88 臨床意義8結(jié) 論10參 考 文 獻11致 謝12摘 要摘要 目的 探討 ELISA 法檢測乙肝兩對半常見影響因素和臨床意義。了解這些因素會造成的結(jié)果，及其處理方法，減少差錯事故發(fā)生，保證實驗結(jié)果的準確性。方法 回顧分析 ELISA 法檢測乙肝兩對半的檢驗步驟，嚴格按照試劑盒說明書檢測，總結(jié)乙肝兩對半檢測的影響因素, 并對臨床意義進行探討。結(jié)果 乙肝檢測時，標本處理不合格、試劑影響因素、操作技術(shù)失誤、檢驗人員的業(yè)務(wù)水平、檢驗過程中的標準操作規(guī)程、檢驗結(jié)果的研讀等是 ELISA 法檢測乙肝乙肝兩對半的影響因素, 兩對半各項指標對臨床診

3、治乙肝具有指導(dǎo)意義。結(jié)論 乙肝兩對半是乙肝臨床治療依據(jù)的重要指標, ELISA 法是檢測乙肝的靈敏方法, 嚴格按照操作步驟, 排除各種影響因素的干擾，加強質(zhì)量控制, 乙肝酶法檢測時要排除各種影響因素的干擾，盡量杜絕出現(xiàn)假陽性、假陰性結(jié)果，確保檢測結(jié)果的準確性。ELISA 試驗以靈敏度較高，特異性較好的特點在臨床廣泛應(yīng)用。但操作中的每個環(huán)節(jié)對試驗的檢測結(jié)果影響較大，如不按常規(guī)操作，有時會出現(xiàn)假陽性和假陰性的情況。我們根據(jù)多年在檢驗室的工作經(jīng)驗，總結(jié)以下可能會影響乙肝五項 ELISA 檢測結(jié)果的因素。關(guān)鍵詞：乙肝檢測；ELISA法；標本；操作；影響因素前 言乙型病毒性肝炎（下稱乙肝）是由乙型肝炎病

4、毒（HBV）引起的一種世界性傳染性疾病， 嚴重危害人們的身體健康。這些肝炎的共同點是可測出 HBV 的血清學(xué)標志， 這些標志包括 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb， 也就是俗稱的乙肝兩對半，乙肝的預(yù)防、診斷與療效等方面很大程度都依賴乙肝兩對半的檢測1。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測乙肝免疫學(xué)標志物的主要方法，具有簡便、靈敏、特異性高等優(yōu)點，成為基層醫(yī)院對乙肝診斷分型療效觀察的主要手段。 但ELISA 測定中影響因素較多，有時可見到一些假陽性或假陰性。 因此，排除各種影響因素的干擾，有利于提高檢測結(jié)果的準確性。1.1乙肝表面抗原（HBsAg）HbsAg由 226 個

5、氨基酸組成，由S基因編碼，有多種亞型。因最早在澳大利亞發(fā)現(xiàn)又稱“澳抗”。HbsA g是H BV 感染后第一個出現(xiàn)的血清學(xué)標志物，HbsA g（+）表明體內(nèi)有乙肝感染，但并不反映乙肝病毒有無復(fù)制、復(fù)制程度、傳染性強弱。也有HbsA g（-）的H BV 感染，是由于乙肝病毒的S基因突變或變異1，導(dǎo)致H bsA g氨基酸序列發(fā)生改變，而使現(xiàn)行的ELISA 試劑不能檢出，要通過HBV -DNA 定量進行確認還有一種情況是雖有乙肝感染，但可能處于窗口期，導(dǎo)致HbsAg不能檢出，要通過流行病學(xué)調(diào)查或進行HBV-DNA 定量等進一步檢查才能明確診斷。 1.2 乙肝表面抗體（HBsAb）HBsAb是乙肝病毒的

6、中和抗體，意味著人體對乙肝病毒產(chǎn)生了抵抗力。乙肝感染者出現(xiàn)HBsA b是乙肝痊愈的一個指標，表明病毒已基本清除。接種疫苗和感染乙肝病毒后依靠自身免疫力清除乙肝病毒的人也會產(chǎn)生此抗體。臨床也會見到HBsAg、HBsAb雙陽性的標本，可能是由于不同亞型的乙肝病毒感染。此外也有學(xué)者證明乙型肝炎病人HBsAb出現(xiàn)后，血清內(nèi)仍有DNA復(fù)制，隨著時間的推移HBV -DNA 的檢出率逐漸下降2-3。一般認為抗體的P/N 值（樣本血清吸光度值與陰性對照吸光度之比）達到 10 以上時，說明體內(nèi)已有免疫力可以預(yù)防HBV 的感染如P/N值在 10 以下，雖然也是抗-HBs陽性，但其保護力減弱甚至不能預(yù)防HBV 感染

7、，此時有必要加強注射乙型肝炎疫苗，使抗-HBs滴度迅速提高，起到保護作用。1.3 乙肝抗原（HBeAg）HbeAg與Dane顆粒在血清中平行出現(xiàn)，與DNA 聚合酶在血循環(huán)中消長動態(tài)也基本一致，使體內(nèi) HBV 復(fù)制及血清具有傳染性的指標HbeAg持續(xù)存在時間一般不超過十周，否則提示感染轉(zhuǎn)為慢性化。H beA g陰轉(zhuǎn)表明病毒復(fù)制水平降低，病變趨于靜止。但臨床上也會遇到HB sA g(+)、HbeA g（-）、HBcA b(+)而HBV -DNA 陽性的病例，因此HBeA g轉(zhuǎn)陰并不意味著病毒的復(fù)制停止或減弱，有學(xué)者認為此現(xiàn)象有可能為血清轉(zhuǎn)換期或HBV -DNA pre-C 區(qū)發(fā)生突變有關(guān)，動態(tài)觀察

8、后仍沒有改變，則可能為前C 區(qū)突變。1.4 乙肝E抗體（HBeAb）HbeAb常出現(xiàn)于HbeAg轉(zhuǎn)陰后。e抗原陰性、e抗體陽性，表明乙肝相對好轉(zhuǎn)，說明病毒復(fù)制趨于減少，預(yù)示患者的傳染性已顯著或相對降低，病毒復(fù)制趨于減少。持續(xù)e抗體陽性，說明乙肝傳染性較弱，但并非完全沒有傳染性。有文獻報道，雖然HbeAg（+）陰轉(zhuǎn)為HbeAb（+）但仍有部分患者HBV -DNA 陽性。此現(xiàn)象有可能與HBV -DNA 前C 區(qū)發(fā)生突變有關(guān)，出現(xiàn)“免疫逃逸”或不同亞型的HBV 重疊感染。1.5乙肝核心抗體（HbcAb）HBcAb常緊繼HBsAg、HBeAg之后再血清中檢出，H bcA b主要分為兩類，一類是HBcI

9、gM 另一類是HbcIgG 。早期以IgM 為主，HBcIgM 在肝炎急性期呈高滴度，是判斷急性乙肝感染的重要指標，隨著急性乙肝的恢復(fù)，抗HBcIgM 滴度降低乃至消失，如持續(xù)高滴度，常表明有慢性化傾向。在慢性活動性乙肝患者中，抗HBcIgM 檢出率及滴度亦較高，說明H BV 復(fù)制活躍，是傳染性強的指標之一；急性感染恢復(fù)期及慢性子持續(xù)性感染以HbcAb-IgG 為主。臨床上常見單項HbcAb陽性，可見于（1） 既往感染；（2） 低水平攜帶；（3）核心窗口期血清中HbsAg、HbeAg消失，而HBsAb還未出現(xiàn)；（4）被動獲得，如經(jīng)輸血和胎盤獲得。因此要通過流行病學(xué)調(diào)查、其他輔助檢查或臨床試驗等

10、方法才能得出準確的臨床診斷。 2影響因素 ELISA法廣泛用于乙肝兩對半檢測。但ELISA測定中影響因素較多，有時可見到一些假陽性或假陰性，醫(yī)院檢驗科就ELISA測定乙肝兩對半的影響因素及對策做如下討論：2.1 樣本采集與處理的影響標本的影響 標本應(yīng)避免溶血,紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)。血塊完全收縮使標本中的非特異性活性物質(zhì)部分或全部失活, 若在血液還未開始凝固時強行離心分離血清, ELISA 測定過程中可形成肉眼可見的纖維蛋白塊, 易造成假陽性結(jié)果。2.1.1標本嚴溶血及混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣的活

11、性，催化底物顯色造成假陽性，嚴重溶血標本禁用。2.1.2采血試管洗滌不徹底、反復(fù)使用易交叉污染；塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性。2.1.3標本凝固不全，正常血液采集后1/22h開始凝固，1824h完全血塊完全收縮。在工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過

12、程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；因此血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?.2 試劑的影響2.2.1 試劑盒的影響 試劑盒的質(zhì)量是保證實驗結(jié)果準確性的必要前提, 各廠家的試劑盒靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性和操作簡便性有一定的差異。試劑盒保存要求在 2 8 環(huán)境,實驗時將試劑盒必須放到室溫平衡 0. 5 h。2.2.2 檢驗人員的影響 檢驗醫(yī)師應(yīng)掌握 ELISA 用于乙肝兩對半測定的質(zhì)控方法原理及失控處理原則, 熟悉操作中易出現(xiàn)問題的實驗環(huán)節(jié), 掌握乙肝兩對半各標志物之間存在意義, 正確使用測定儀器及加樣器

13、。2.2.3不同方法學(xué)的檢測試劑，會使兩對半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實際工作中常用ELISA檢測HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學(xué)發(fā)光檢測為陽性。除方法學(xué)的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對變異抗原或亞型乙肝標志物檢測存在差異，建議試劑廠家對劑的制備應(yīng)該考慮亞型及型濃度的問題。3 操作技術(shù)的影響3.1 首先要使用一次性加樣吸頭，必免污染，另外加樣過程中一定要垂直加入準確量的血清，加樣要準確。避免出現(xiàn)加錯孔或把血清或酶噴濺到反應(yīng)孔外，造成污染。且勿觸碰包被板底部，使抗體（抗原）脫落影響結(jié)果。3.2 溫浴影響 溫浴一般ELISA檢測乙肝五項的放置的溫度為37，如果溫度太高就會使包

14、被物脫落失活，而溫度達不到37時，則影響反應(yīng)速度，從而影響測定結(jié)果。3.3 冼滌 是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手冼條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，半自動與全自動冼板機使用不當(dāng)也會影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”造成假陽性或假陰性；所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應(yīng)用去離子水清冼幾遍。3.4 洗板 通過洗滌分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及酶標記物, 也可以把非特異性吸附蛋白質(zhì)、血球、細菌中酶等干擾去掉。每次洗板都應(yīng)使用新鮮制造的蒸餾水或去離子水稀釋洗滌劑

15、, 防止洗滌液受污染影響洗板效果。3.5 顯色 顯色是 ELISA 法測定乙肝兩對半中最后一步溫育, 溫育使反應(yīng)孔內(nèi)的酶標物質(zhì)辣根酶催化底物生成有色產(chǎn)物。此過程受溫度、時間和光線等條件影響, 通常底物顯色在37 10 40 min 反應(yīng)徹底完成, 底物液受光照會自行變色, 顯色反應(yīng)需在避光環(huán)境進行。4 檢測結(jié)果研讀的影響4.1 結(jié)果判斷須在終止液加入后 10 min 內(nèi)完成, 以免出現(xiàn)孔內(nèi)結(jié)晶, 影響酶標儀的測試。操XXX要有高度的責(zé)任心, 確保試劑的質(zhì)量及有效期的同時, 對于復(fù)查后的異常結(jié)果應(yīng)重新采集標本再予復(fù)查, 在整個實驗過程中加入外部質(zhì)控血清進行嚴格的質(zhì)量控制。所有復(fù)檢要有詳細記錄。4

16、.2肉眼判斷結(jié)果時，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準確性，必須使用酶標儀檢測，以保結(jié)果一致性。5 HooK效應(yīng)影響Hook狀效應(yīng)是指抗原過剩致酶聯(lián)免疫(ELISA)一步法測抗原出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。在抗原抗體反應(yīng)時，抗原抗體須在一定比例范圍內(nèi)才能出現(xiàn)最大凝集，當(dāng)標本中待測抗原濃度相當(dāng)高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，抗原過量或抗體過量都會導(dǎo)致兩者交聯(lián)度降低，從而導(dǎo)致凝集程度與實際濃度不符，出現(xiàn)結(jié)果將低于實際含量，嚴重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 隨著ELISA一步法的應(yīng)用，一些標本中抗原含量過高，產(chǎn)生HooK效應(yīng)。影響檢測結(jié)果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對半定量法

17、可以減HooK反應(yīng)的發(fā)生。6 干擾物質(zhì)的影響 有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果；常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF因子可與標記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用5630分鐘滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會導(dǎo)致本底過深影響檢測結(jié)果。7 藥物的影響 高效價的乙肝免疫球蛋白會與HBsAg形成

18、復(fù)合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應(yīng)，導(dǎo)致乙肝兩對半少見模式的出現(xiàn)，如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時，在孕第8、9、10月常規(guī)注射200mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出；而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性，HBeAg陽性和HBcAb陽性等少見模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過胎盤進入胎兒體內(nèi)與胎兒血液中的HBsAg結(jié)合形成復(fù)合物；則新生兒HBsAg檢測呈陰性；用0.5M的鹽酸處理標本1小時可提高出率。8 臨床意義8. 1 HbsAg 乙肝病毒表面抗原, 為已經(jīng)感染病毒的標

19、志, 并不反映病毒有無復(fù)制、復(fù)制程度、傳染性強弱。8. 2 HbsAb 乙肝病毒表面抗體, 為中和性抗體標志, 是是否康復(fù)或是否有抵抗力的主要標志。乙肝疫苗接種者, 若僅此項陽性, 應(yīng)視為乙肝疫苗接種后正?，F(xiàn)象。8. 3 HbeAg 乙肝病毒 e 抗原, 為病毒復(fù)制標志。持續(xù)陽性 3個月以上則有慢性化傾向。8. 4 HbeAb 乙肝病毒 e 抗體, 為病毒復(fù)制停止標志, 病毒復(fù)制減少, 傳染性較弱, 但并非完全沒有傳染性。8. 5 HbcAb 乙肝病毒核心抗體, 為曾經(jīng)感染過或正在感染者都會出現(xiàn)的標志, 核心抗體 IGM 是新近感染或病毒復(fù)制標志, 核心抗體是感染后就會產(chǎn)生的, 對于輔助兩對半

20、檢查有一定的意義。結(jié) 論 乙肝是當(dāng)前嚴重危害人們身體健康的傳染病之一, 血清兩對半檢測對乙肝的診斷, 病程監(jiān)測, 療效觀察起到了一定的作用, 常用的檢測方法為 ELISA 法。但 ELISA 檢測中受到許多因素的影響, 如標本留取與處理、加樣、孵育、洗板、顯色及結(jié)果判讀, 如不注意可能導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果。具體操作中應(yīng)嚴格按照操作步驟進行, 設(shè)立陰陽對照及臨界值測定, 同時做好室內(nèi)質(zhì)控、室間評價, 以嚴謹?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)檢測每一份標本, 對有疑義的檢驗結(jié)果要復(fù)查, 才能保證檢測質(zhì)量, 杜絕假陽、假陰性結(jié)果。 為預(yù)防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的12周內(nèi)，血清中可檢出HBsAg成份

21、，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能夠把它檢出；如電化學(xué)發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內(nèi)不應(yīng)作HBsAg檢測。 要避免標本出現(xiàn)嚴重溶血，血紅蛋白中含有血紅素基團,其有類似過氧化物的活性。 因此在以 HRP 為標記酶的 ELISA測定中, 如果血清標本中血紅蛋白濃度過高, 就很容易在溫育過程中吸附于 ELISA 包被孔中不易洗去, 從而造成結(jié)果異常。 為此標本采集和進一步處理時要避免出現(xiàn)溶血。 標本的保存時間不宜過長如果標本在冰箱中放置時間過長, 第一可能因為標本在采集和處理中細菌污染導(dǎo)致結(jié)果異常, 原因有二:細菌在生長過程中分泌的一些酶類物質(zhì)可能會對抗

22、原抗體或 HRP 蛋白產(chǎn)生分解作用, 而影響結(jié)果;某些細菌的內(nèi)源性酶如果洗滌不徹底本身會對測定產(chǎn)生非特異性干擾。 第二長時間放置可使得檢測的抗原或抗體免疫活性減弱,可出現(xiàn)假陰性。 為克服以上干擾, ELISA 測定的血清宜新鮮采集;如果不能立即測定, 建議血清標本在無菌操作下分離, 可在2 8下保存1周。如不是無菌操作建議冰凍保存, 樣品長時間保存, 應(yīng)存于-70以下。血清不能用 NaN3因為 NaN3 可抑制一步法 ELISA 測定系統(tǒng)中 HRP 酶的活性, 屬于酶抑制劑。 總之，乙肝兩對半檢測必須排除各種影響因素的干擾才能為臨床提供正確可靠的檢測結(jié)果。參 考 文 獻1 蔣福國 薛海斌 乙肝五項酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)果常見影響因素分析J. 中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 10(9):10572 臧勇 酶聯(lián)免疫吸附法檢測乙肝五項結(jié)果常見影響因素分析J 中國實用醫(yī)藥 2010,