牛蒡子苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞抑制作用及其作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減牛蒡子苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞抑制作用及其作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究（作者:_單位: _郵編: _） 【摘要】 目的通過(guò)牛蒡子苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞株(CAPAN-1)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其是否具有抗胰腺癌作用。方法在CAPAN-1細(xì)胞培養(yǎng)液中加牛蒡子苷，培養(yǎng)72 h并觀察癌細(xì)胞的增殖抑制率及癌細(xì)胞形態(tài)變化。流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)CAPAN-1細(xì)胞周期及凋亡率；TUNEL法檢測(cè)CAPAN-1細(xì)胞凋亡率；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CAPAN-1細(xì)胞的增殖凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白(bax、bcl-2)表達(dá)。用CAPAN-1細(xì)胞制作Balb/c裸小鼠荷瘤模型，連續(xù)每天腹腔注射牛蒡子苷（10 mg·k

2、g-1·d-1）10d，以5-FU（30 mg·kg-1·d-1）作陽(yáng)性對(duì)照觀察抑瘤率。結(jié)果牛蒡子苷抑制CAPAN-1細(xì)胞生長(zhǎng)；阻滯CAPAN-1細(xì)胞周期于G0/G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；通過(guò)上調(diào)bax蛋白表達(dá)（P0.01），下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)（P0.05）誘導(dǎo)CAPAN-1細(xì)胞凋亡；抑制荷瘤裸小鼠腫瘤生長(zhǎng)，抑瘤率為41.7%。結(jié)論牛蒡子苷具有抗胰腺癌活性，其作用機(jī)理之一是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 【關(guān)鍵詞】 牛蒡子苷； 抗腫瘤活性； 細(xì)胞凋亡； CAPAN-1細(xì)胞株 Abstract：ObjectiveTo evaluate the anti-tumor effect a

3、nd mechanism of arctiin on the human pancreas cancer cell (CAPAN-1) in vitro and vivo. MethodsCAPAN-1 cell was cultured in medium containing serial concentration of arctiin for 72 hours. Then the growth rate and the morphological change were analyzed. Cell apoptosis percentage was measured by TUNEL

4、method and FCM. Cell cycle phase distribution was measured by FCM. The expression of proliferation and apoptosis associated proteins of bax,bcl-2 in CAPAN-1 cell were determined using immunocytochemistry. CAPAN-1 cell tumor-bearing nude mice were intraperitoneally administered arctiin and 5-FU and t

5、he tumor growth rate was observed.ResultsArctiin could inhibit proliferation of CAPAN-1 cell. The cell cycle was arrested in G0/G1 phase and apoptosis was induced（P0.05）. The onset of apoptosis was related to the up-regulation of bax protein（P0.01）and down-regulation of bcl-2 in protein level（P0.05）

6、. Arctiin could inhibit the tumor growth, and inhibition rate was 41.7%.ConclusionThese studies suggest that arctiin can inhibit CAPAN-1 cells growth and one of mechnnisnms is to induce cell apoptosis. Key words：Arctiin； Anti-tumor effect； Apoptosis； CAPAN-1 cell line 牛蒡子是具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、解毒利咽的中藥，且常用于抗癌方

7、劑中。牛蒡子主要含牛蒡子苷（arctiin）、牛蒡子苷元（arctigenin）、牛蒡子酚A、B（lappaol A,B）、脂肪油等1。近來(lái)研究表明，牛蒡子苷及牛蒡子苷元在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有抗癌活性 24。牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞是否具有抑制作用尚無(wú)報(bào)道，為進(jìn)一步研究牛蒡子苷的抗腫瘤活性，利用CAPAN-1細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討牛蒡子苷是否具有抗胰腺癌活性及其作用機(jī)理。 1 材料 牛蒡子苷購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；CAPAN-1細(xì)胞株由上海細(xì)胞研究所提供；FCS-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，胎牛血清，抗生素，胰蛋白酶等（GIB Co）；SP免疫組化試劑盒，小鼠抗人bcl-2及bax單克隆抗體（

8、Santa Cruz Co）。 2 方法 2.1 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取FCS-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAPAN-1細(xì)胞3ml(細(xì)胞濃度約為6.5×103個(gè)·ml-1)，接種于直徑35mm的培養(yǎng)皿中。隨機(jī)分為用藥組和對(duì)照組。用藥組分別加入用0.02%二甲亞砜溶解的牛蒡子苷0.5，1，1.5mg·ml-1；對(duì)照組加入0.02%二甲亞砜。每一濃度3個(gè)重復(fù)培養(yǎng)皿，培養(yǎng)72h，每24h用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)癌細(xì)胞數(shù)，設(shè)對(duì)照組癌細(xì)胞增殖率為100%，用下面公式計(jì)算各用藥組癌細(xì)胞增殖率。 增殖率（%）=（用藥組各時(shí)段癌細(xì)胞數(shù)用藥組開(kāi)始癌細(xì)胞數(shù)）/（對(duì)照

9、組各時(shí)段癌細(xì)胞數(shù)對(duì)照組開(kāi)始癌細(xì)胞數(shù)）×100%。 2.2 癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)皿中CAPAN-1細(xì)胞用藥前后的變化。 2.3 FCM細(xì)胞周期檢測(cè) 收集對(duì)照組和加牛蒡子苷1 g·ml-1的用藥組培養(yǎng)24，48，72h的CAPAN-1細(xì)胞；PBS洗滌后，4下用75%酒精固定12 h以上；離心除去酒精，PBS洗滌，加入10mg·ml-1 RNA酶溶液150 l，37水浴30 min，加入碘化丙啶（PI），300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后4下放置15 min，用FCM測(cè)定細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞的百分比及細(xì)胞凋亡率。 2.4 DNA末端原位標(biāo)記染色法（TUNEL）檢測(cè)

10、細(xì)胞凋亡 在培養(yǎng)皿中放置蓋玻片，CAPAN-1細(xì)胞在蓋玻片粘壁生長(zhǎng)后，用藥組加入1 g·ml-1牛蒡子苷，收集對(duì)照組和用藥組培養(yǎng)24，48，72h附細(xì)CAPAN-1胞的蓋玻片，按TUNEL試劑盒標(biāo)記染色，結(jié)果判斷：以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色為陽(yáng)性。光鏡下計(jì)算凋亡指數(shù)（Apoptotic index,AI）。AI是指每張TUNEL玻片選取5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多的高倍鏡視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的百分比。 2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)增殖凋亡調(diào)控相關(guān)基因bax及bcl-2的蛋白表達(dá) 分別收集對(duì)照組和加牛蒡子苷1 g·ml-1的用藥組培養(yǎng)48 h的CAPAN-1細(xì)胞，用S-P法進(jìn)行染色。小

11、鼠bax單克隆抗體按1200稀釋，bcl-2單克隆抗體按150稀釋，陰性對(duì)照以PBS代替抗體。結(jié)果判斷：細(xì)胞染色呈棕黃色為陽(yáng)性，隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，測(cè)定每一指標(biāo)的標(biāo)記指數(shù)（labeling index，LI），重復(fù)3次，取均值。LI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%。 2.6 荷瘤Balb/c裸小鼠腫瘤抑制實(shí)驗(yàn) 體重21 g左右的雌性Balb/c裸小鼠20只，于裸小鼠右側(cè)腋窩皮下接種CAPAN-1細(xì)胞2×106 個(gè)（0.1 ml），接種后第8天隨機(jī)分成對(duì)照組和用藥組，每組10只。牛蒡子苷組用牛蒡子苷10 mg·kg-1（用0.02%二甲亞砜溶解），陽(yáng)性對(duì)照組用

12、5-FU 30 mg·kg-1·d-1,對(duì)照組用0.02%二甲亞砜溶液，腹腔注射1次/d，連續(xù)10 d。移植腫瘤細(xì)胞第30天拉頸處死小鼠，切除腫瘤稱重并按下面公式計(jì)算抑瘤率： 抑瘤率(%) = (1用藥組平均瘤重/ 對(duì)照組平均瘤重)×100%。 2.7 資料統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)資料用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，各組間比較用t檢驗(yàn)。 3 結(jié)果 3.1 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 用藥組與對(duì)照組相比CAPAN-1細(xì)胞數(shù)和增殖率減少，均呈濃度和時(shí)間依賴性（見(jiàn)圖1及表1）。表1 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞增殖率的影響 3.2 癌細(xì)胞

13、形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察CAPAN-1細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，見(jiàn)用藥組癌細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞變小，折光性差，有的細(xì)胞破碎，隨后脫落飄浮在培養(yǎng)液中。而對(duì)照組的癌細(xì)胞形態(tài)上無(wú)明顯改變，生長(zhǎng)良好。 3.3 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞周期和凋亡率的影響 FCM檢測(cè)結(jié)果：用藥組與對(duì)照組比較細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡（見(jiàn)表2）。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果：用藥組與對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率增高，差異具有顯著性意義，且隨處理時(shí)間增加細(xì)胞凋亡率亦增加（見(jiàn)表3）。 表2 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞周期及凋亡的影響 表3 TUNEL法檢測(cè)CAPAN-1細(xì)胞的凋亡率 3.4 牛蒡子苷對(duì)bax及bcl-2蛋白表

14、達(dá)的影響 處理48 h后，與對(duì)照組相比bax標(biāo)記指數(shù)LI增加（t=38.09 P0.01，bcl-2標(biāo)記指數(shù)LI降低（t=5.19 P0.05），見(jiàn)表4。表4 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞bax、bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比較，* P0.01 *，P0.05 3.5 牛蒡子苷對(duì)荷瘤Balb/c裸小鼠腫瘤抑制實(shí)驗(yàn) 牛蒡子苷組和陽(yáng)性對(duì)照組裸小鼠平均瘤重小于對(duì)照組平均瘤重，差異具有顯著性意義（t=5.89， t=12.42，P0.01），陽(yáng)性對(duì)照組裸小鼠平均瘤重小于牛蒡子苷組平均瘤重，差異具有顯著性意義（t=5.89, t=12.42，P0.01）。見(jiàn)表5。表5 牛蒡子苷對(duì)荷瘤Balb/c

15、裸小鼠瘤重和抑瘤率的影響 4 討論 最近實(shí)驗(yàn)研究表明，牛蒡子苷在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有抗肺癌，白血病活性。與5-FU、環(huán)磷酰胺及順鉑合用，可減少或阻止抗癌劑抗藥性的增加，并能夠抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用58。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)胰腺癌細(xì)胞株（CAPAN-1）的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步證明牛蒡子苷是否具有抗胰腺癌活性。 在利用牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)中。牛蒡子苷能抑制CAPAN-1細(xì)胞的增殖；通過(guò)觀察CAPAN-1細(xì)胞的形態(tài)，觀察到癌細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制；TUNEL標(biāo)志法觀察到CAPAN-1細(xì)胞凋亡；FCM檢測(cè)CAPAN-1細(xì)胞周期和凋亡率結(jié)果顯示，牛蒡子苷先將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1

16、期，然后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。bax和bcl-2是一對(duì)凋亡相關(guān)調(diào)控基因，bax主要通過(guò)與其家族bcl-2形成二聚體而發(fā)生作用。當(dāng)bcl-2表達(dá)較高時(shí)，bcl-2和bax形成異源二聚體而抑制凋亡；當(dāng)bax表達(dá)較高時(shí)，bax之間形成同源二聚體而促進(jìn)凋亡9。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛蒡子苷作用于CAPAN-1細(xì)胞后bcl-2基因表達(dá)減弱，bax基因表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明其可下調(diào)bcl-2及上調(diào)bax表達(dá)，這可能為牛蒡子苷誘導(dǎo)CAPAN-1細(xì)胞凋亡的機(jī)理之一。從癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中可得出牛蒡子苷能抑制體外培養(yǎng)的CAPAN-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 在體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)癌細(xì)胞有抑制或殺傷作用的藥物，在活體中由于各種綜合因素的作用

17、不一定仍具有抑制腫瘤的作用。為此進(jìn)行了CAPAN-1細(xì)胞荷瘤裸小鼠腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)果牛蒡子苷能夠抑制荷瘤裸小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。但抑瘤率較5-FU弱，表明牛蒡子苷在活體上也具有抑制CAPAN-1細(xì)胞的活性。通過(guò)對(duì)CAPAN-1細(xì)胞的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，證明牛蒡子苷具有抗胰腺癌活性，其作用機(jī)理之一是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 郭蘭忠. 現(xiàn)代實(shí)用中藥學(xué)，第1版M. 北京: 人民衛(wèi)生出版社，1999: 602. 2 Takasaki M,Konoshima T,Komatsu K,et al. Antitumor-promoting activity of lignans from the aerial pa

18、rt of Saussurea medusalJ. Cancer Lett,2000,158(1): 63. 3 Hwang Y K，Kim D C，Hang W I.,et al.Inhibitory Effect of Artemisia princeps Pampan. Extract on Growth of Cancer Cell LinesJ. Korean J.Nutrition ,1998, 31（4）: 799. 4 Yu Wei-ping,Wang Guo-zhen,Gao Lei,et al. In vitro growth inhibition effect of he

19、patocyte growth factor on SMMC-7721 human hepatocellular carcinoma cellsJ.Journal of southeast university(Medical Science Edition), 2002, 3:16. 5 Hiano T, Goroh M, Oka K. Natural flavonoids and lignans poteat cytostatic agents against human leukemic HL-60 cellJ.Life sci,1994,55(13): 1061. 6 Hirose M,Yamaguchi T,Lin C,et al. Effects of arctiin on PhIP-induced mam- mary，colon and pancre