土壤酶活活性測(cè)定方法

1、土壤脲酶（urease）活性的測(cè)定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的測(cè)定是以尿素為基質(zhì)，酶促水解生成的氨與酚類化合物起反應(yīng)生成藍(lán)色的靛酚，顏色深度與氨含量相關(guān)，因而用于脲酶活性的測(cè)定。（二）試劑1）甲苯2）10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至100mL。3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：184克 和147.5克氫氧化鉀溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7，用水稀釋至1000毫升。4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀釋至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。

2、將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將2溶液各20毫升混合，用蒸餾水稀釋至100毫升。5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.4717克硫酸銨溶于水并稀釋至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液。 （三）測(cè)定步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀釋了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚鈉，仔細(xì)混合，加入3mL次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20分鐘,用水稀釋至刻度。將著色液在紫外分光光度計(jì)上于578nm處進(jìn)行比色測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以

3、光密度值為縱坐標(biāo)繪制曲線圖。（2）土壤中脲酶活性的測(cè)定稱取10 g土壤置于100mL容量瓶中。用2mL甲苯處理15分鐘。往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL檸檬酸緩沖液（pH6.7）。仔細(xì)混合后，將瓶放在37恒溫箱中，放置3 h。與此同時(shí)，進(jìn)行以水代替基質(zhì)，及無(wú)土壤的基質(zhì)對(duì)照測(cè)定。培養(yǎng)結(jié)束后，用熱至38的水稀釋至刻度。搖勻，將懸液過(guò)濾。吸取1mL濾液于50mL容量瓶中，用蒸餾水加至10mL。然后按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作加入苯酚鈉等試劑，顯色，比色，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出氨態(tài)氮含量。以每克土壤在37下24h內(nèi)酶解尿素釋放的NH3-N 的毫克數(shù)來(lái)表示脲酶活性。土壤蛋白酶活性測(cè)定方法：銅鹽比色法（

4、一）方法原理本法基于以精膠為基質(zhì)，酶解后所釋放的氨基酸使其與銅鹽反應(yīng)形成藍(lán)色復(fù)合物。用比色測(cè)定顏色深度，計(jì)算出氨基酸含量，來(lái)度量酶的活性。（二）試劑1）1%精膠2）甲苯3）銅-磷酸鹽溶液： 27.3g CuCl2·H2O溶于1 L水；64.5g Na2HPO4·12H2O溶于500mL 水，加入7.2g NaOH，稀釋至1L；57.21g Na2B4O7溶于1.5L 水，加入100毫升0.1 mol/L HCL稀釋至2L，使用按照1：2：2的體積分?jǐn)?shù)前將上述、混合。4）甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取 267.9mg甘氨酸溶于蒸餾水，稀釋至 1 L （1mL含50µg N

5、H3-N）。（三）操作步驟 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取0、5、10、15、20 mL 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水加至20 mL，然后加入20 mL 新配制的銅-磷酸鹽溶液。顯色后，用分光光度計(jì)在650nm處測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）土壤蛋白酶活性測(cè)定稱取5g土壤置于100mL 三角瓶中，加入甲苯2mL ，放置15 min，加入20mL 1%精膠溶液，于37恒溫培養(yǎng)24h，于此同時(shí)，以水代替基質(zhì)作為對(duì)照。 培養(yǎng)結(jié)束后，將懸液過(guò)濾，取10mL 濾液，加水10mL，銅-磷酸鹽溶液20mL。顯色后，用分光光度計(jì)在650nm處測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出NH3-N含量。以每克土壤在37下24h內(nèi)酶解蛋白質(zhì)釋放的NH3

6、-N的質(zhì)量（µg）表示蛋白酶活性。土壤磷酸酶測(cè)定方法：磷酸苯二鈉法（一）方法原理本法基于以磷酸苯二鈉為基質(zhì)，酶解釋放出的酚，使其與氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑反應(yīng)生色。用比色法測(cè)定出游離的酚量，用以表示磷酸酶活性。（二）試劑配制1）0.5磷酸苯二鈉（用緩沖液配制）；2）pH5醋酸鹽緩沖液、pH7檸檬酸鹽緩沖液、pH9.4硼酸鹽緩沖液；3）氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亞胺，用10mL 96乙醇溶解，貯于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用；4）酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液：酚原液取1g重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至1L，貯于棕色瓶中；酚工作液取10mL 酚原

7、液稀釋至1L（每毫升含0.01毫克酚）；5）甲苯；6）0.3硫酸鋁溶液。（三）操作步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL緩沖液和4滴氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg·g-1濃度的酚標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度。30min后比色測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （2）土壤磷酸酶的測(cè)定 稱取5g風(fēng)干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，輕搖15min后，加入20mL 0.5磷酸苯二鈉（酸性磷酸酶用醋酸鹽緩沖液；中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩

8、沖液；堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液），仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱，在37下培養(yǎng)24h。后于培養(yǎng)液中加100mL 0.3硫酸鋁溶液并過(guò)濾。 吸取3mL濾液于50mL容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所述方法顯色。用硼酸緩沖液時(shí)，呈現(xiàn)藍(lán)色，在風(fēng)光光度計(jì)上于660nm處比色。 磷酸酶活性，以37下24h后1g土壤中釋放處的酚的毫克數(shù)表示。土壤蔗糖酶測(cè)定方法：3,5- 二硝基水楊酸比色法（一）方法原理蔗糖酶酶解所生成的還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。（二）試劑1）酶促反應(yīng)試劑：基質(zhì)5%蔗糖（用pH5.5

9、磷酸緩沖液配制）；甲苯2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL） 預(yù)先將分析純葡萄糖置80烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱取500mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4保存期約一星期）。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水楊酸試劑（DNS試劑） 將5.0g 3,5-二硝基水楊酸溶于200mL 2N NaOH溶液中（不適宜用高溫促溶），接著加入 500mL含130g酒石酸鉀鈉的溶液，混勻。再加入5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解后，定容至1000mL。暗處保存?zhèn)溆谩＃ㄈy(cè)定步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)

10、曲線繪制分別吸1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于試管中，再補(bǔ)加蒸餾水至1mL，加DNS試劑3mL混勻，于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min（從試管放入重新沸騰時(shí)算起），取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長(zhǎng)540nm處比色，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）土壤蔗糖酶測(cè)定稱取5 g土壤，置于100mL三角瓶中，加10 mL水、1mL甲苯。搖勻土壤均勻分散后，放置15分鐘，加入15mL5%蔗糖-磷酸緩沖液。搖勻、塞緊，放于37恒溫箱中，培養(yǎng)24h。按此操作，用不加土壤的基質(zhì)和150干熱滅菌1h的土壤進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后，用濾紙

11、過(guò)濾，取1mL濾液，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，測(cè)定并由標(biāo)準(zhǔn)曲線其中還原糖含量。土壤蔗糖酶活性，以1g土壤在37時(shí)，24h釋放出的葡萄糖毫克數(shù)來(lái)表示。過(guò)氧化氫酶測(cè)定(容量法) 1. 試劑配制 a. 0.3過(guò)氧化氫溶液：按1:100將30%H2O2用水稀釋b. 3N 硫酸c. 0.1N 高錳酸鉀（1/5KMnO4）溶液：稱取化學(xué)純高錳酸鉀3.161g，溶于1升無(wú)CO2蒸餾水中，貯于綜色瓶中，備用。2. 操作步驟（1）取2g風(fēng)干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸餾水和5mL 0.3H2O2溶液。（2）同時(shí)設(shè)置對(duì)照，即三角瓶中注入40mL蒸餾水和5mL 0.3過(guò)氧化氫溶液，而不加土樣。（3）將三角

12、瓶放在振蕩機(jī)上振蕩20min后，加入5mL3N硫酸，以穩(wěn)定未分解的過(guò)氧化氫。再將瓶中懸液用慢速濾紙過(guò)濾。吸取25mL濾液，用0.1N高錳酸鉀滴定至淡粉紅色終點(diǎn)。3. 結(jié)果計(jì)算 用于滴定土壤濾液所消耗的高錳酸鉀量（毫升數(shù)）為B，用于滴定25mL原始的過(guò)氧化氫混合液所消耗的高錳酸鉀量（毫升數(shù)）為A。 （A-B）×T即為過(guò)氧化氫酶活性。以20min后1g土壤的0.1N高錳酸鉀的毫升數(shù)表示。式中T為高錳酸鉀滴定度的校正值。（就是最后換算成每克，所以還要測(cè)土壤含水量）高錳酸鉀溶液標(biāo)定稱取0.2g（準(zhǔn)至0.0001g）于105110烘至恒重的基準(zhǔn)草酸鈉。溶于100mL（8+92）硫酸溶液中，用配

13、制好的高錳酸鉀溶液c（KMnO4）=0.1mol/l滴定，近終點(diǎn)時(shí)加熱至65，繼續(xù)滴定至溶液呈粉紅色保持30s，同時(shí)作空白試驗(yàn)。高錳酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)濃度按下式計(jì)算c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700式中          c（1/5KMnO4）=高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液之物質(zhì)的量濃度，mol/L；                 m草酸鈉之

14、質(zhì)量，g；                  V1高錳酸鉀溶液之用量，mL；                   V2空白試驗(yàn)用高錳酸鉀溶液之用量，mL；        

15、0.06700與1.00mL高錳酸鉀溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜牟菟徕c的質(zhì)量。脫氫酶測(cè)定（比色法）取20g土壤于50ml三角瓶中，加0.2g碳酸鈣?；靹蚝蠹?ml1%三苯基四唑氯化物，再加水至最大持水量的90%，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（30，相對(duì)濕度70%）培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，加25ml甲醇，振蕩5min，過(guò)濾。再用甲醇多次洗滌漏斗上的土壤，直至獲得無(wú)色濾液。合并濾液和洗液并定容50ml或100ml，在分光光度計(jì)上于460nm處比色。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取10ml分別含20300微克的三苯基四唑氯化物溶液，加10mgNaHSO3還原，顯色后在分光光度計(jì)上于46

16、0nm處比色測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活性表示及計(jì)算：以20g土壤中氫離子的微升數(shù)表示。X=av*150.35 式中：a1ml濾液中甲醇的毫克數(shù)（查標(biāo)準(zhǔn)曲線） V濾液體積（ml） 150.35將甲醇量換算成氫的體積（微升）的系數(shù)多酚氧化酶活性的測(cè)定鄰苯三酚比色法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.5mol/LHCl稀釋成各種不同濃度。定容后，在分光光度計(jì)上于430nm處比色測(cè)定。以光密度值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）操作步驟稱取1g風(fēng)干土壤樣品（過(guò)0.25mm篩），置于50mL三角瓶中，然后注入10mL1%鄰苯三酚溶液，將瓶?jī)?nèi)含物搖蕩后放在30恒溫箱培養(yǎng)2h。取出后加4mL