丙戊酸鈉誘導(dǎo)骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株 MUTZ1凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

1、丙戊酸鈉誘導(dǎo)骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株 MUTZ1凋亡的實(shí)驗(yàn)研究         08-03-03 15:22:00     編輯：studa20     作者：趙慧慧，陳寶安, 高沖，邵澤葉，夏國華，丁家華，孫耘玉，【摘要】  為了探討丙戊酸鈉( sodium valproate， VPA)對(duì)骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株MUTZ1的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)VPA對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用；采用光學(xué)顯

2、微鏡和電子顯微鏡觀察VPA作用后細(xì)胞形態(tài)的變化；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)不同濃度VPA作用后細(xì)胞凋亡的比例和細(xì)胞周期分布的變化。結(jié)果顯示： VPA對(duì)MUTZ1細(xì)胞的生長抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性；經(jīng)4 mmol/L VPA處理MUTZ1細(xì)胞72小時(shí)后,細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)特征，光學(xué)顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞胞體固縮、核固縮、核碎裂及凋亡小體；透射電子顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)邊集、胞漿濃縮、密度增加，胞漿內(nèi)大小不規(guī)則的染色質(zhì)團(tuán)塊；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡率隨著VPA濃度的增加而逐步增高，G0/G1期細(xì)胞比例隨著VPA濃度的增加而逐漸增多，S期細(xì)胞比例逐漸減低,細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。

3、結(jié)論： VPA通過G0/G1期阻滯誘導(dǎo)MUTZ1細(xì)胞凋亡，從而抑制MUTZ1細(xì)胞增殖。 【關(guān)鍵詞】  骨髓增生異常綜合征      Apoptosis of Human Myelodysplastic Syndrome Cell Line MUTZ1 Induced by Sodium Valproate       Abstract    To study the effects of sodium valproate (VPA) on hum

4、an myelodysplastic syndrome cell line MUTZ1. The  cell proliferation was determined by  MTT assay, apoptotic morphological features were observed by light microscopy and transmission electronmicroscopy, cell apoptosis and cell cycle shift were analyzed by flow cytometry (FCM). The results

5、showed that VPA could inhibit the growth of MUTZ1 cells in doseand timedependent manners. The typical apoptotic morphological features appeared in MUTZ1 cells treated with 4 mmol/L VPA for 72 hours. Pyknosis of cells and nuclei, disintegration of nuclear chromatin and apoptotic body could be observe

6、d by light microscopy. Aggregation and margination of  nuclear chromatin,     concentration of plasm, increment of density and chromatin mass of irregular size could be observed by  transmission electronmicroscope. The flow cytometric analysis indicated that the VPA cou

7、ld induce cell apoptosis, apoptosis rate increased in dosedependent manner, ratio of cells at G0/G1 phase increased and ratio of cells at S phase decreased  in dosedependent manner, the cells were arrested at G0/G1 phase. It is concluded that the VPA can induce apotosis and inhibite proliferati

8、on of MUTZ1 cells via arresting cells at G0/G1 phase.    Key words    sodium valproate； MDS； MUTZ1 cell line； apoptosis    J Exp Hematol 2007; 15(4):743-747    骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組以血細(xì)胞質(zhì)、量異常和高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展為急性白血病為特征的惡性克隆性造血干細(xì)胞疾病。由于本病具有高度的異質(zhì)性,目前臨床尚無明確有效的治

9、療方法。組蛋白去乙?；敢种苿℉DACI）可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長增殖1-3，它的應(yīng)用標(biāo)志著一種全新的腫瘤治療途徑。丙戊酸鈉(sodium valproate, VPA)是一種傳統(tǒng)的抗癲癇病藥物，毒副作用輕微，長期使用耐受性好，其在抗癲癇病有效治療濃度時(shí)表現(xiàn)出很強(qiáng)的HDACI活性4。    本實(shí)驗(yàn)研究了VPA抑制MDS細(xì)胞株MUTZ1生長增殖以及誘導(dǎo)其凋亡的作用。     制劑和試劑    VPA由連云港恒瑞制藥廠惠贈(zèng),純度為99.2% ,分子式為C8H15NaO

10、2,以PBS配制成0.5 mol/L濃度,過濾分裝,貯存于-20,實(shí)驗(yàn)證明所用藥物濃度的PBS含量對(duì)細(xì)胞生長無影響。RPMI 1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品，小牛血清購自杭州四季清有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品，Annexin VFITC凋亡和細(xì)胞周期分析試劑盒為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。    細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)    人MDS細(xì)胞株MUTZ1來源自德國Brauschweig細(xì)胞中心5。MUTZ1是MDSRAEB細(xì)胞系,免疫表型顯示前B細(xì)胞的表面標(biāo)記(CD10+,CD19

11、+,cyIgM+),染色體核型表現(xiàn)為高頻率的染色單體斷裂及交換、5號(hào)染色體長臂的丟失6。細(xì)胞在5% CO2, 37條件下,用含10%小牛血清,青霉素(100 U/ml),鏈霉素(100 g/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期，臺(tái)盼藍(lán)拒染法表明細(xì)胞活力95%。    MTT比色試驗(yàn)    取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，洗滌，重懸于含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×105/ml，接種于96孔板,加入不同濃度的VPA,每孔總體積為200 l,另設(shè)空白孔和對(duì)照孔，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)

12、孔,分別于加藥后0、1、2、3和4天進(jìn)行檢測(cè),于每次檢測(cè)前4小時(shí)每孔加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 l; 37，5% CO2條件下繼續(xù)孵育4小時(shí),然后終止培養(yǎng)，離心、棄上清,每孔加入150 l  DMSO,搖床混勻充分溶解結(jié)晶物；在全自動(dòng)酶標(biāo)儀波長540 nm處測(cè)定吸光度A值。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。    光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察    4 mmol/L VPA處理MUTZ1細(xì)胞72小時(shí)后收集細(xì)胞懸液,離心 ,涂片,常規(guī)WrightGiemsa染色,觀察細(xì)胞形態(tài)。    透射電子顯微

13、鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察    4 mmol/L VPA處理MUTZ1細(xì)胞72小時(shí)后收集細(xì)胞懸液,離心后快速固定于2.5%的冷戊二醛液中，2小時(shí)后，1%鋨酸再固定1小時(shí)，丙酮梯度脫水，Epon812樹脂包埋，半薄切片定位，70 nm超薄切片，醋酸鈾檸檬酸鉛雙重電子染色，在JEM1200透射電子顯微鏡下觀察。    細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)    分別收集0、1、2和4 mmol/L VPA處理72小時(shí)的細(xì)胞, 4用PBS洗滌2次,1×AnnexinV緩沖液懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×

14、;106/ml,取100 l懸液,加入AnnexinVFITC 5 l， PI  10 l，避光孵育15分鐘,每管加入300 l的1×AnnexinV緩沖液,FCM檢測(cè)凋亡細(xì)胞陽性率。AnnexinV()PI()為活細(xì)胞, AnnexinV()PI(+)為機(jī)械損傷細(xì)胞， AnnexinV(+)PI()為早期凋亡細(xì)胞, AnnexinV (+)PI(+)為晚期凋亡細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中以AnnexinV（+）作為凋亡細(xì)胞。    分別收集0、1、2和4 mmol/L VPA處理72小時(shí)的細(xì)胞(約2×106個(gè)),用PBS洗滌2次,用70%的冷乙醇于

15、4下固定24小時(shí)以上,離心并重懸于1 ml PBS,加1 ml  PC緩沖液,置室溫20分鐘,離心去上清,加100 g/ml RNase 50 l,再加入50 g/ml PI  500 l ,4 室溫避光30分鐘，F(xiàn)CM分析細(xì)胞周期。    統(tǒng)計(jì)分析    應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),應(yīng)用t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異,以p0.05為差異具有顯著意義。    結(jié)    果    VPA對(duì)MUTZ1細(xì)胞生長的抑制作用    0.5 mmol/L  VPA作用于MUTZ1細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞的生長增殖無明顯影響（p0.05），而較高濃度（1-6 mmol/L）的VPA可明顯抑制細(xì)胞的