HIF－1α反義寡核苷酸體外對人腦膠質(zhì)瘤細胞U251的作用

1、HIF1反義寡核苷酸體外對人腦膠質(zhì)瘤細胞U251的作用                                      作者：易顯富, 楊賢義, 郭清浩, 康中山     

2、; 摘  要  目的:研究缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF1）反義寡核苷酸(ASODN)轉(zhuǎn)染對人膠質(zhì)瘤細胞增殖及凋亡的影響,探討以HIF1為靶點進行反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染治療膠質(zhì)瘤的有效性。方法:設(shè)計合成針對HIF1的寡核苷酸片段.實驗分6組：空白對照組、脂質(zhì)體組、正義組和反義組（1.0 mol/l、2.5 mol/l和5.0 mol/l）。利用脂質(zhì)體包裹瞬時轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細胞系U251,MTT法檢測細胞增殖;采用AO/EB染色及末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡的變化。結(jié)果:轉(zhuǎn)染后各組細胞增殖抑制率分別為（1.30±0.05）、（1.98±0.35）、（2.47

3、77;0.48）、（22.30±2.08）、（33.60±4.19）和（56.20±4.22）。轉(zhuǎn)染HIF1反義寡核苷酸組較各對照組相比細胞增生下降, 凋亡增加（P<0.01）。 結(jié)論:HIF1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤U251細胞系可以抑制細胞增生并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡，HIF1有望成為一個極具潛力的腫瘤治療的靶點。 關(guān)鍵詞  反義寡核甘酸類，反義；缺氧誘導(dǎo)因子1；膠質(zhì)瘤Abstract:Objective To investigate the effects of antisense oligodeoxynucleotides(ASODN) tar

4、geting HIF-1 on the apoptosis and proliferation of human glioma cell line U251 and to evaluate their efficacy as anticancer therapeutics.  Methods ASODN targeting HIF-1 was designed and syntherized. Cultured U251 cells were devided into 6 groups:control group,lipsomes group,sense oligodeoxynucl

5、eotides(SODN) group,1.0 mol/l ASODN group,2.5 mol/l ASODN group and 5.0 mol/l ASODN group. ODNs targeting HIF-1 transfected into U251 cells mediated by liposomal reagent. After transfected for 24 h , the cultured cells were harvested .Inhibitory rate(IR) by ASODN was determined by the colorimetri MT

6、T cell viability;Apoptosis index (AI) and the apoptotic cell morphological changes were measured by acridine orange-ethidium bromide (AOEB) double fluorescent dye staining and TUNEL under fluorescence inverted microscopy. Results The IR in 6 group was （1.30±0.05）,（1.98±0.35）,（2.47±0.4

7、8）,（22.30±2.08）,（33.60±4.19）,（56.20±4.22）,respectively. The IR and AI rate in 3 ASODN groups was significantly higher than that in any other control groups（P<0.01）. Conclusion ASODN targeting HIF1 may induce U251 apoptosis and inhibit proliferation. HIF1 could be a promising antica

8、ncer target .Key words:Oligodeoxynucleotide,Antisense;Hypoxia inducible factor 1;Glioma 惡性腫瘤在生長過程中,組織增生過快必然會造成局部組織缺氧和供能與耗能之間的不平衡1。缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor 1, HIF1）是調(diào)節(jié)腫瘤細胞對缺氧等微環(huán)境發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)的主要核轉(zhuǎn)錄因子,能通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和糖酵解相關(guān)酶的表達,增加供血、供氧、供能,改善這一失衡,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)2。HIF1是決定HIF1活性的亞單位,在許多惡性腫瘤中的過表達與腫瘤的血管

9、形成，侵襲轉(zhuǎn)移，放化療耐受等密切相關(guān), 抑制腫瘤中HIF1的表達則具有抗腫瘤效應(yīng)。本實驗利用反義寡核苷酸技術(shù)(antisenseoligodeoxynucleotides, ASODN)合成針對HIF1的寡核苷酸片段,并利用陽離子脂質(zhì)體包裹瞬時轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細胞系U251, 觀察其對膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的影響，為以HIF1為靶點的反義寡核苷酸治療膠質(zhì)瘤提供實驗依據(jù)。1  材料與方法1.1  主要材料人膠質(zhì)瘤細胞系U251（中科院上海細胞生物化學(xué)研究所）。TUNEL試劑盒、陽離子脂質(zhì)體Dosper(Roche公司)。SP試劑盒，鼠抗人HIF1（福州邁新生物技術(shù)公司），細胞培養(yǎng)用

10、1640（Gibco公司），胎牛血清（浙江杭州四季青公司），氯化鈷(上海一新試劑公司)。吖啶橙(AO)/溴乙錠(EB)(Fluka公司)。1.2  方法1.2.1  HIF1 ODN的合成與修飾:HIF1 AsODN 5'GCCGGCGCCCTCCAT 3',并設(shè)置了HIF1 SODN作為對照, 5'ATGGAGGGCGCCGGC-3'。全部堿基進行硫代修飾，其中HIF1 AsODN 5'FAM熒光標記。1.2.2  細胞培養(yǎng)與缺氧模型建立:人膠質(zhì)瘤U251細胞系復(fù)蘇后,加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置于37

11、 、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長達對數(shù)生長期時，換以含終濃度為125 mol/l氯化鈷的1640培養(yǎng)液進行化學(xué)模擬缺氧, 置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)備用。1.2.3  實驗分組與轉(zhuǎn)染:細胞懸液直接種至6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染時取對數(shù)生長期細胞，并融合50%60%，每種處理有5孔。實驗分六組：不同濃度反義寡核甘酸組（終濃度分別為1.0,2.5和5.0 mol/l）、空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對照組和正義寡核甘酸轉(zhuǎn)染對照組（終濃度為5.0 mol/l）。按照Dosper轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行細胞轉(zhuǎn)染。1.2.4  反義寡核苷轉(zhuǎn)染后熒光觀察:轉(zhuǎn)染15 min,6 h,

12、24 h和48 h在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照，了解ODN在細胞內(nèi)的代謝和穩(wěn)定性，并初步判斷轉(zhuǎn)染效率。1.2.5  MTT法檢測膠質(zhì)瘤細胞增殖活性:U251細胞經(jīng)消化后計數(shù), 以1.5×105個/l接種96孔板,每孔200 l,10%小牛血清1640培養(yǎng)基,5%CO2、37 孵箱中培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)細胞分組同前。按照脂質(zhì)體試劑盒說明書進行脂質(zhì)體包裹寡核苷酸片段及瞬時轉(zhuǎn)染,分別在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后在培養(yǎng)細胞中加入MTT (5 /l)50 l/孔,繼續(xù)孵育4 h,加入DMSO100 l/孔,輕搖10 min后檢測波長490 nm的吸光度(A)值，每組3孔。計算細胞生長抑制

13、率抑制率=(空白對照組平均A值-用藥組平均A值)/空白對照組平均A值×100%。1.2.6  AO/EB雙染法檢測膠質(zhì)瘤細胞凋亡:各組細胞轉(zhuǎn)染后24 h分別消化離心收集棄上清,加入500 l培養(yǎng)液,配成細胞懸液,再加入實驗用AO/EB 溶液20 l,混勻,置1滴于載玻片上,熒光顯微鏡下觀察200個細胞,分別計數(shù)早期凋亡細胞(VA)、晚期凋亡(NVA)、活細胞(VN)及非凋亡的死亡細胞(NVN),計算凋亡率。凋亡率=(VA+NVA)/(VA+NVA+VN+NVN)×100%1.2.7  TUNEL標記法:實驗分組及轉(zhuǎn)染同“1.2.3”所述。24 h后將各組

14、玻片取出按照TUNEL試劑盒說明書進行染色。觀察結(jié)果以所見細胞核有棕黃色顆粒者為陽性細胞,每個樣品至少計數(shù)100個細胞中的陽性細胞數(shù),重復(fù)計數(shù)3次,取平均值，作為細胞凋亡指數(shù)（Apoptotic index,AI）。                             1.3  統(tǒng)計學(xué)方法所有結(jié)果均以x&

15、#177;s表示,不同組別的比較采用單因素方差分析。2  結(jié)果2.1  HIF1 AsODN后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染熒光標記的HIF1 ASODN后15 min ODN粘附于細胞膜表面，但胞核無熒光積聚。轉(zhuǎn)染后6 h幾乎所有細胞均出現(xiàn)核內(nèi)均勻熒光積聚。此后核內(nèi)熒光持續(xù)存在，至轉(zhuǎn)染后24 h開始消退。48 h后,ODN僅偶見于個別細胞(見圖1)。2.2  MTT法檢測膠質(zhì)瘤細胞增殖活性    HIF1 ASODN轉(zhuǎn)染對膠質(zhì)瘤細胞有不同程度的抑制作用，且在一定的濃度范圍內(nèi)隨著ASODN濃度的增加而增強，與各對照組相比均有顯著性差異(P<

16、;0.01), 而SODN組、脂質(zhì)體組與空白對照組間比較無顯著性差異(P>0.05),見表1。2.3  AO/EB雙染法檢測膠質(zhì)瘤細胞凋亡AO/EB雙熒光染色鏡檢可用于估計受檢細胞群體中細胞凋亡的發(fā)生率?；罴毎籄O染色發(fā)綠色熒光,細胞核呈現(xiàn)一至數(shù)個大小不等的圓珠狀凋亡小體，邊緣光滑、清晰,熒光亢進且均勻一致，符合細胞凋亡的核形態(tài)特征(見圖2 )。細胞膜受損的晚期凋亡細胞則同時被EB 染色,核形態(tài)特征相同,但發(fā)橙紅色熒光。非凋亡的死亡細胞,核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)(見圖2 )。不同濃度HIF1 ASODN作用后各組的細胞凋亡率見表1 ,在同一時間點各濃度組凋亡率與空白對照組

17、相比均有顯著差異(P<0.01);在同一時間點脂質(zhì)體組、SODN組凋亡率與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)。2.4  TUNEL法檢測膠質(zhì)瘤細胞凋亡轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)后經(jīng)末端標記法可觀察到凋亡細胞胞核被染成棕黃色(見圖3)。不同濃度的HIF1 ASODN均可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡，凋亡指數(shù)與各對照組相比均有增加（P<0.01），見表1。表1  HIF1 ODN轉(zhuǎn)染對膠質(zhì)瘤細胞增殖凋亡的影響(%, n=5,  略)注：與空白對照組相比較，*P>0.05；與各對照組相比較，P<0.013  討論反義寡核苷酸技術(shù)是根據(jù)堿基互補原則通

18、過人工合成一段與靶基因及其mRNA互補的寡核苷酸片段,與相應(yīng)靶基因或mRNA特異性結(jié)合,干擾基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,從而達到削弱或抑制該基因功能的目的3。利用反義寡核苷酸技術(shù)的這一特點,特異性抑制癌變中發(fā)揮重要作用的癌基因及生長因子等的表達,遏制細胞的惡性增生,誘導(dǎo)其凋亡從而達到治療腫瘤的目的。HIF1是腫瘤細胞在低氧環(huán)境下賴以生長的核轉(zhuǎn)錄因子，由和兩亞單位組成異二聚體，HIF1決定其活性，而HIF1的功能則與維持其異二聚體結(jié)構(gòu)有關(guān)。HIF1在供氧正常時通過氧依賴性的泛素蛋白酶體途徑快速降解，而缺氧時HIF1與腫瘤抑制蛋白pVHL結(jié)合降解受阻大量積聚。HIF1與其下游靶基因啟動子中一致性D

19、NA序列結(jié)合，啟動VEGF、IGF2、Glut和CA IX等與腫瘤血管生成、增殖、凋亡和能量代謝密切相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄。反義基因技術(shù)在腫瘤防治中的應(yīng)用，最重要的一點是選擇合適的靶基因。最理想的靶點是腫瘤細胞生長所必需而又不存在于正常細胞的細胞成分。Zhong H4等對腦腫瘤和正常腦組織研究發(fā)現(xiàn)，在癌組織中HIF1過表達,且在腫瘤壞死明顯的區(qū)域和腫瘤浸潤的邊緣, HIF1表達明顯增多,而正常腦組織則未見HIF1表達。Sun 等56在動物實驗中證實用瘤內(nèi)注射反義HIF1質(zhì)粒能下調(diào)其靶基因VEGF表達,減少腫瘤微血管密度，完全抑制微小腫瘤生長，并能增強癌癥免疫治療的效力。聯(lián)合應(yīng)用反義HIF1質(zhì)粒和pV

20、HL質(zhì)粒效果更佳，腫瘤HIF1、VEGF、微血管密度顯著減少，凋亡增加。Zhang Q7等證實HIF1反義基因治療能顯著抑制人舌鱗癌細胞增殖誘導(dǎo)其凋亡。氯化鈷能在體外培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生類似缺氧狀態(tài)，細胞對氯化鈷刺激和缺氧刺激具有相同的氧感受、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制，因此氯化鈷模擬的體外實驗與體內(nèi)缺氧狀態(tài)下的研究結(jié)果具有很強的可比性89。在本實驗中我們用氯化鈷復(fù)制膠質(zhì)瘤細胞缺氧模型，誘導(dǎo)HIF1表達，應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)合成特異性的寡核苷酸，以陽離子脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細胞系U251以抑制HIF1mRNA和蛋白的表達，應(yīng)用MTT法，AO/EB雙染標記法和TUNEL等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HIF1反義寡核苷酸后

21、膠質(zhì)瘤細胞生長受到抑制，生長抑制率有顯著性差異（P<0.01）。細胞凋亡是指在活組織中,由內(nèi)在基因編碼調(diào)控的程序性細胞死亡過程,是機體一種正常生理現(xiàn)象。細胞的凋亡決定細胞的死亡, 腫瘤細胞凋亡說明機體可通過自主地清除惡變的或可能惡變的細胞來對抗腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。細胞凋亡常參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展, 研究細胞凋亡對評估腫瘤預(yù)后有一定意義。AO/EB染色法則可以半定量檢測凋亡, 它不但可以檢測細胞的凋亡率, 而且還能了解膜受損細胞率, 是研究細胞凋亡的重要檢測方法。TUNEL方法是一種將細胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)檢測相結(jié)合的有效而敏感的凋亡原位定量研究的方法。本實驗中將兩種方法結(jié)合應(yīng)用，

22、研究發(fā)現(xiàn)HIF1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染使膠質(zhì)瘤細胞凋亡率顯著增加。細胞增生和凋亡失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),并直接關(guān)系到腫瘤患者的愈后。本研究應(yīng)用反義HIF1寡核苷酸轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細胞可以抑制腫瘤細胞的增生并誘導(dǎo)細胞凋亡,為進一步進行以HIF1為靶點的抗腫瘤治療研究提供了一定的實驗依據(jù)。（文中圖13見封三）參  考  文  獻1 Harris AL.Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growthJ.Nat Rev Cancer,2002,2(1):3847.     2 Richard DE, Berra E, Pouyssegur J. Angiogenesis: how a tumor adapts to hypoxiaJ. Biochem Biophys Res Commun,1999,266(3):718-722.     3 Stein CA,Cheng YC.Antisense oligonucleotides as therap