MMP-2、TIMP-2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的臨床病理研究

1、MMP-2、TIMP-2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的臨床病理研究 【摘要】 目的研究口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2），基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2（TIMP-2）的表達(dá)。方法采用免疫組化SP法檢測(cè)60例OSCC、35例非典型增生、20例正?？谇火つぶ蠱MP-2、TIMP-2的表達(dá)情況。結(jié)果 OSCC中MMP-2、TIMP-2的表達(dá)均高于非典型增生組（P0.05），在非典型增生組中表達(dá)高于正?？谇火つそM（P0.05）。MMP-2的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P0.05），與年齡、腫瘤大小、TNM分期無關(guān)（P0.05）。TIMP-2與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密

2、切相關(guān)（P0.05），與年齡、腫瘤大小、腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM分期無關(guān)（P0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MMP-2/ TIMP-2比值顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P0.05）。結(jié)論MMP-2、TIMP-2是OSCC轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)標(biāo)志，MMP-2/TIMP-2比值對(duì)評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛能有重要意義。 【關(guān)鍵詞】 口腔鱗狀細(xì)胞癌免疫組織化學(xué)基質(zhì)金屬蛋白酶-2基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2Expression of Matrix Metalloprateinase-2(MMP-2) and Tissue Inhibitors of Metalloproteinase-2(TIMP-2) in Oral S

3、quamous Cell Carcionoma Abstract: Purpose To study the expression of matrix metalloprateinase-2 (MMP2) and tissue inhibitors of metalloproteinase-2(TIMP-2) in oral squamous cell carcinoma (OSCC). Methods The expression of MMP-2 and TIMP-2 were examined by immunohistochemistry SP method in 20 cases w

4、ith normal oral mucosa, 35 cases with atypical hyperlasia and 60 cases with oral squamous cell carcinoma.Results The expressions of MMP-2 and TIMP-2 in OSCC were significantly higher than those in atypical hyperlasia（P0.05）. The expressions of MMP-2 and TIMP-2 in atypical hyperlasia were significant

5、ly higher than those in oral mucosa（P0.05）. MMP-2 expression in OSCC significantly associated with lymph node metastasis and cellular differentiation（P0.05）, but has no relationship with age , tumor size and TNM stage（P0.05）. TIMP-2 in OSCC significantly associated with lymph node metastasis（P0.05）,

6、 but has no relationship with age , tumor size, cellular differentiation and TNM stage（P0.05）. MMP-2/TIMP-2 in OSCC with lymph node metastasis was significantly higher than that in no lymph node metastasis（P0.05）. Conclusion MMP-2 and TIMP-2 are important biological marker reflecting metastasis of O

7、SCC andMMP-2/TIMP-2 may play an important role in evaluating lymph-node metastasis potential . Key words: oral squamous cell carcionoma;immunohistochemistry; matri metalloprateinase-2; tissue inhibitors of metalloproteinase-2 細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）與基底膜（basement membrane，BM）是腫瘤轉(zhuǎn)移的屏障，對(duì)ECM和BM的

8、降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是誘導(dǎo)ECM降解最重要的酶類。本項(xiàng)研究通過對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）及其抑制物基質(zhì)蛋白酶組織抑制因子-2（tissue inhibitors of metalloproteinase-2，TIMP-2）在正常口腔黏膜、非典型增生、口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中表達(dá)的觀察，探討它們?cè)贠SCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，以及與OSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系。 1 材料與方法 1.1

9、 資料來源 本研究所用石蠟包埋組織標(biāo)本選自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1999年1月至2002年12月的住院患者?？谇击[狀細(xì)胞癌患者60例，均為口腔外科作口腔鱗狀細(xì)胞癌根治性手術(shù)的患者，術(shù)前未作放療或化療，術(shù)后經(jīng)病理診斷確診為口腔鱗狀細(xì)胞癌，男性28例，女性32例：年齡45歲34例，年齡45歲26例，平均年齡48.01歲；腫瘤最大直徑3cm者27例，3cm者33例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例；腫瘤分期根據(jù)UICC標(biāo)準(zhǔn)TNM分期，期22例，期21例，+期17例；按鱗癌病理分級(jí)法，其中高分化鱗癌19例，中分化鱗癌24例，低分化鱗癌17例?？谇环堑湫驮錾±?5例，來自其他口腔疾病手術(shù)標(biāo)

10、本。正?？谇火つ?0例，取自口腔門診活檢標(biāo)本，均未做過任何治療。 1.2 主要試劑 鼠抗人MMP-2、TIMP-2單克隆抗體，免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 所有組織均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋， 包埋組織標(biāo)本作4m連續(xù)切片，分別做HE染色和免疫組化染色。免疫組化SP法染色參照試劑說明書進(jìn)行，MMP-2、TIMP-2均采用高溫直接煮沸法修復(fù)抗原。用已知的陽性切片作陽性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。 1.4 結(jié)果判定 MMP-2、TIMP-2均以實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒判斷為陽性著色。定量及圖像分析采用同濟(jì)醫(yī)大千屏

11、影像公司HPLAS-1000病理圖像分析系統(tǒng),將切片上的陽性染色信號(hào)轉(zhuǎn)為灰度進(jìn)行分析。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)中多組之間使用方差分析以及q檢驗(yàn)，兩組之間使用t檢驗(yàn)。 2 結(jié) 果 2.1 MMP-2、TIMP-2在正?？谇火つそM織、非典型增生、口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)和分布 MMP-2的陽性表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞，增生上皮細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)中的纖維母細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜、胞漿中，偶爾可見細(xì)胞核著色，陽性細(xì)胞呈片狀、灶狀或散在分布（圖1、2）。MMP-2在正常口腔黏膜中亦有表達(dá)。表1顯示從正?？谇火つ?、非典型增生到口腔鱗狀細(xì)胞癌，MMP-2的凈

12、灰度值逐漸增高，OSCC組中MMP-2的凈灰度值為 76.2129.65，顯著高于非典型增生（42.6919.26，P0.05），在非典型增生的凈灰度值顯著高于正?？谇火つさ?7.568.02（P0.05）。 TIMP-2的陽性表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞和增生上皮細(xì)胞的胞膜和胞漿中，呈異質(zhì)性分布，陽性表達(dá)亦可見于少數(shù)間質(zhì)細(xì)胞（圖3）。TIMP-2在正常口腔黏膜組中表達(dá)微弱，從正常口腔黏膜、非典型增生到OSCC，TIMP-2的凈灰度值逐漸增高，OSCC組中TIMP-2的凈灰度值為51.0422.81，顯著高于非典型增生（37.4113.85，P0.05），在非典型增生的凈灰度值顯著高于正?？谇火つさ?

13、5.978.51（P0.05）。 OSCC中MMP-2/TIMP-2比值顯著高于非典型增生與正?？谇火つぃ≒0.05）。 2.2 MMP-2、TIMP-2表達(dá)與OSCC臨床病理參數(shù)間關(guān)系 MMP-2的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MMP-2的凈灰度值（87.5635.91）顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（62.0929.87，P0.05）。隨著腫瘤分化程度的降低，MMP-2的表達(dá)增高，中、低分化組MMP-2的凈灰度值顯著高于高分化組（P0.05）。MMP-2在患者年齡，腫瘤大小，腫瘤臨床分期各組間的表達(dá)無顯著性差異（P0.05）。 TIMP-2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的凈灰度值（57.6429

14、.51）顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（40.2619.94，P0.05）。TIMP-2在患者年齡，腫瘤大小，腫瘤分化程度，臨床分期各組中的表達(dá)無顯著性差異（P0.05）。 在OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，MMP-2/TIMP-2比值顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P0.05），MMP-2/TIMP-2比值在患者年齡，腫瘤大小，腫瘤分化程度，臨床分期各組之間的比較無顯著性差異（P0.05）。 3 討 論 細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜的降解是腫瘤向鄰近組織浸潤(rùn)進(jìn)而向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必要步驟。MMPs是誘導(dǎo)ECM降解最重要的酶類，目前已明確的人類MMPs有20余種，根據(jù)其作用底物的不同分為四類：間質(zhì)膠原酶、明膠酶、間質(zhì)溶解素、膜型金屬

15、蛋白酶（membrane-type metalloprateinase，MT-MMP）。其中明膠酶包括MMP-2、MMP-9，分子量分別為72kD、92kD，主要底物有明膠、型底膜膠原。TIMPs是MMPs的專一抑制劑可以通過結(jié)合MMPs的活性部位，影響MMPs分子對(duì)基底物的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)其抑制作用，這種結(jié)合是以非共價(jià)鍵方式，而且不可逆轉(zhuǎn)1，2。目前已發(fā)現(xiàn)4種TIMP，分別命名為TIMP14，其中TIMP-2是分子量為21kD的糖蛋白，它可與MMP-1、MMP-2和MMP-3呈1:1結(jié)合，其中對(duì)MMP-2的抑制作用較TIMP-1強(qiáng)710倍以上，而對(duì)MMP-1的抑制作用較TIMP-1弱， TIMP-

16、2除能與活性MMP-2結(jié)合抑制其活性外，還能以非共價(jià)鍵與明膠酶原結(jié)合，從而抑制明膠酶原的活化，與明膠酶原結(jié)合的TIMP-2仍能抑制MMP-2的活性。 我們用免疫組化SP法檢測(cè)了 60例OSCC，35 例非典型增生， 20 例正?？谇火つぶ蠱MP-2蛋白的表達(dá)，從正常口腔黏膜、非典型增生到OSCC，MMP-2的表達(dá)逐漸增高，MMP-2在正常口腔黏膜中表達(dá)微弱，凈灰度值為17.568.02，在OSCC中的凈灰度值為76.2129.65 ，提示MMP-2在OSCC發(fā)生過程中具有重要意義，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致4，5。在實(shí)驗(yàn)中觀察到在OSCC組織中MMP-2在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有分布，并在腫瘤浸潤(rùn)的前

17、緣，癌巢的周邊部分表達(dá)明顯增多，提示癌巢邊緣細(xì)胞及腫瘤浸潤(rùn)前緣的細(xì)胞是一群獲得浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移特性，增生活躍的細(xì)胞亞群，它們能夠誘導(dǎo)MMP-2產(chǎn)生，降解ECM和癌巢基底膜，因而具有較高的侵襲潛能。有研究表明，成纖維細(xì)胞在生理狀況下很少表達(dá)MMPs，然而OSCC腫瘤細(xì)胞膜上的MT-MMP可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中MMP-2的活化，OSCC腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液亦可促進(jìn)成纖維細(xì)胞中MMP-1的表達(dá)，OSCC腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)可促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也觀察到MMP-2在腫瘤間質(zhì)中的表達(dá)主要位于成纖維細(xì)胞的胞膜和胞漿中，提示OSCC腫瘤細(xì)胞與其周圍成纖維細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)和活化之間存在著一定

18、的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)中還觀察到在腫瘤細(xì)胞周圍MMP-2的表達(dá)由遠(yuǎn)及近存在著由陰性逐漸變?yōu)殛栃缘内厔?shì)，提示腫瘤細(xì)胞可以通過可溶性介質(zhì)或膜結(jié)合分子與間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行信息變換協(xié)同產(chǎn)生和調(diào)節(jié)MMP-2。在對(duì)乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤進(jìn)行研究表明，在不同的腫瘤組織中，MMP-2有不同程度的升高并與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中MMP-2在OSCC低分化組中的表達(dá)高于高分化組，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示MMP-2的表達(dá)與腫瘤的惡性度和侵襲能力呈正相關(guān)，MMP-2可以作為臨床工作中判斷OSCC預(yù)后的分子指標(biāo)，與不良預(yù)后有關(guān)。 TIMP-2在鱗癌組中的表達(dá)與正常口腔黏膜組和不典型增生組比較，均有

19、顯著性差異，顯示細(xì)胞在發(fā)生癌變過程有通過TIMP-2表達(dá)的上調(diào)抑制癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的特性。本研究顯示MMP-2、TIMP-2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，在OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MMP-2/TIMP-2比值顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示隨著腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，MMP-2與TIMP-2的表達(dá)均有上調(diào)，但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MMP-2的上調(diào)幅度大于TIMP-2。 我們認(rèn)為宿主對(duì)MMP-2的上調(diào)存有復(fù)雜的反饋機(jī)制，可以誘導(dǎo) 1 陳華江. 基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系J. 國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè),2000,28:23-24.Yagasaki H, Kawata N, Takimoto Y, et al. Histopathological analysis of angiogenic factors in renal cell carcionomaJ. Int J Urol, 2003, 10(4):220-227.Zhang X, Yamashita M, Uetsuki H, et al. Angiogenesis in renal cell carcinoma: Evaluation of microvessel density, vascular endothelial growth factor and matrix metallopro