PCNA反義寡核苷酸抑制膀胱癌細(xì)胞BIU-87體外增殖的研究

1、    PCNA反義寡核苷酸抑制膀胱癌細(xì)胞BIU-87體外增殖的研究        【摘要】目的檢測(cè)脂質(zhì)體介導(dǎo)增殖細(xì)胞核抗原（ PCNA）反義寡核苷酸抑制人膀胱癌細(xì)胞 BIU-87體外增殖活性效果。方法 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)及 MTT比色法評(píng)價(jià)反義寡核苷酸對(duì) BIU-87細(xì)胞體外增殖的影響；應(yīng)用免疫組化法 (SABC法)檢測(cè) PCNA蛋白表達(dá)情況。結(jié)果脂質(zhì)體介導(dǎo) PCNA反義寡核苷酸組與對(duì)照組比較， BIU-87細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制（P<0.05）, 12小時(shí)后可完全抑制

2、PCNA蛋白表達(dá)，24、36小時(shí)后仍有極顯著的抑制作用（P<0.01）；脂質(zhì)體介導(dǎo)反義寡核苷酸組與單純反義寡核苷酸組比較，前者抑制作用提高50倍以上；脂質(zhì)體介導(dǎo)正義寡核苷酸組、單純脂質(zhì)體組與對(duì)照組比較均無此抑制作用（P>0.05）。結(jié)論脂質(zhì)體介導(dǎo) PCNA反義寡核苷酸可抑制人膀胱癌細(xì)胞BIU-87體外增殖活性。應(yīng)用反義技術(shù)封閉PCNA基因、抑制 PCNA蛋白表達(dá)，為膀胱癌的基因治療提供了新的思路和探索?！娟P(guān)鍵詞】膀胱腫瘤增殖細(xì)胞核抗原脂質(zhì)體反義寡核苷酸 The inhibition of BIU-87 cell proliferation by liposome conjugate

3、d antisense oligonucleotides targeting the mRNA encoding proliferating cell nuclear antigenZENG Fuqing,WANG Tongguang,ZHU Zhaohui,et alDepartment of Urology,Xiehe Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022【Abstract】ObjectiveTo evaluate the inhibition effect of liposome conjugated antisense olig

4、onucleotides on the BIU-87 proliferation.MethodsThe human bladder cancer cell line BIU-87 was treated with antisense oligodeoxynucleotides targeting the mRNA encoding proliferating cell nuclear antigen (PCNA) with lipofectin.The inhibition of proliferation was studied with cell growth curves and MTT

5、 method.The expression of PCNA was detected immunohistochemically.ResultsThe cell proliferation was inhibited effectively by antisense oligodeoxynucleotides with lipofectin (P0.05).The protein expression of PCNA was inhibited completely at 12 hours and effectively at 24 to 36 hours (P0.01).Lipofecti

6、n could enhance the effect by about 50 times.The sense oligodeoxynucleotides showed no such effect (P0.01).ConclusionsAntisense oligodeoxynucleotides conjugated with lipofectin might be a hopeful method to inhibit the proliferation of bladder cancer cell by inhibiting the expression of PCNA.Further

7、investigations are needed in order to use this method in bladder cancer therapy.【Key words】Bladder neoplasmsProliferating cell nuclear antigenLiposomesAntisense oligodeoxynucleotide使用針對(duì)PCNA mRNA的反義寡核苷酸封閉增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)，對(duì)人體胃癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，對(duì)正常細(xì)胞影響很小1。至今國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見應(yīng)用反義技術(shù)封閉PCNA表達(dá)，阻止細(xì)胞增殖后對(duì)膀胱癌生物學(xué)行為(致瘤性、生長(zhǎng)速度、

8、轉(zhuǎn)移能力)的研究報(bào)道。本研究將初步探討脂質(zhì)體(lipofectin)介導(dǎo)的反義PCNA片段轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞BIU-87后對(duì)其體外增殖活性的影響。材料和方法一、細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株BIU-87由北京醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研究所提供，用含10%滅活胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)液在 37、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代。二、PCNA mRNA反義寡核苷酸的合成PCNA mRNA反義寡核苷酸由上海生工生物工程公司合成，經(jīng)硫代修飾、純化、凍干粉保存?zhèn)溆谩Ｐ蛄腥缦拢?1)反義寡核苷酸(ASODN)：5GACCAGGCGCGCCTCGAA3；(2)正義寡核苷酸(SO

9、DN)：5TTCGAGGCGCGCCTGGTC3。使用前加去離子水溶解，于95水溶5分鐘，冰上驟冷2分鐘后加入一定量的不含血清的培養(yǎng)液，根據(jù)所需濃度稀釋后使用。三、PCNA反義寡核苷酸脂質(zhì)體導(dǎo)入法參考Lipofectin使用說明及文獻(xiàn)提供的方法并略加改進(jìn)2。四、 BIU-87細(xì)胞生長(zhǎng)速度按上述方法將寡核苷酸(正義或反義)用脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染 BIU-87細(xì)胞，將 BIU-87細(xì)胞以1×104/ml濃度種于96孔板中，每孔100l，培養(yǎng) 6小時(shí)后加入含20% FBS的 RPMI 1640培養(yǎng)液100l繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)定為 0點(diǎn),以后每24小時(shí)于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)3次，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)

10、復(fù)孔，取其平均值。按文獻(xiàn)方法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線3。五、 MTT比色法檢測(cè)BIU-87細(xì)胞的增殖活性用上述方法處理細(xì)胞后 6小時(shí)，加含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)后，加入5mg/ml MTT繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，吸棄150 l上清，加入150l DMSO (二甲基亞砜)，振蕩、溶解形成的甲月贊顆粒，立即于酶標(biāo)儀下570nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值。六、免疫組化法檢測(cè)PCNA蛋白表達(dá)采用SABC法。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定：陰性對(duì)照細(xì)胞不顯色。陽性細(xì)胞胞核著色呈棕黃色，邊界清楚，胞漿無染色。七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)和2檢驗(yàn)。結(jié)果一、生長(zhǎng)速度空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和脂質(zhì)體+SODN組之間BIU-87

11、細(xì)胞的生長(zhǎng)差異無顯著性(P<0.05) ,至第5天細(xì)胞達(dá)80%融合。脂質(zhì)體+ASODN組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑(P<0.05)，至第5天才開始明顯增長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制率達(dá)64%85%。二、MTT比色法檢測(cè) BIU-87細(xì)胞增殖活性空白對(duì)照組A值0.45±0.03，脂質(zhì)體對(duì)照組A值0.44±0.04，單純10mol/L ASODN組A值0.42±0.02，脂質(zhì)體 +0.2mol/L SODN組A值0.41±0.02，各組間差異無顯著性(P>0.05)。脂質(zhì)體+0.2mol/L ASODN組A值0.35±0.02，與上述各組間差異有顯著性(P

12、<0.05 )。三、SABC免疫組化法檢測(cè)PCNA蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞核明顯染色，陰性對(duì)照組核不顯色。各組細(xì)胞不同時(shí)間PI值見表1，其中脂質(zhì)體+ASODN組12小時(shí)后未見 PCNA表達(dá)，24小時(shí)及36小時(shí)后與其它各組差異仍有有極顯著性(P0.01)。48小時(shí)后脂質(zhì)體 + ASODN組與其它各組差異無顯著性(P>0.05)。其它各對(duì)照組間差異無顯著性(P0.05)。表1免疫組化染色法檢測(cè)PCNA蛋白表達(dá)分組PI值(%)12h24h36h空白對(duì)照27.0±2.734.8±1.957.3±3.1脂質(zhì)體對(duì)照23.6±4.635.2±2.061.

13、3±5.5SODN26.4±3.635.4±2.358.6±5.1ASODN011.4±0.235.8±6.5     討論 作為一種新的可能的治療手段，基因治療日益受到關(guān)注。已經(jīng)證明PCNA是一種細(xì)胞增殖所必需的核抗原。作為DNA聚合酶的重要輔助蛋白，它出現(xiàn)在所有增殖期的細(xì)胞核中：G1期開始出現(xiàn)，S期達(dá)高峰，G2和M期逐漸下降，這是一種核周期性抗原4。PCNA作為細(xì)胞增殖的標(biāo)記，在多種腫瘤中過度表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)甚少。Sakakura等1運(yùn)用針對(duì)PCNA的反義寡核苷酸完全抑制了多種胃癌細(xì)

14、胞的 PCNA表達(dá)及增殖。在膀胱癌研究中也已證實(shí)： PCNA的過度表達(dá)與膀胱癌的分期、分級(jí)以及預(yù)后都有密切關(guān)系5。因此，我們采用針對(duì) PCNA的反義寡核苷酸封閉膀胱癌細(xì)胞株BIU-87 PCNA表達(dá)，探討用于膀胱癌治療的可行性。單純使用硫代修飾合成的 PCNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率低，代價(jià)昂貴，且抑制細(xì)胞增殖的效率不高。Lipofectin是一種陽離子脂質(zhì)體，可與 DNA自發(fā)地混合形成脂質(zhì)體DNA復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的攝取。 Bernnet等首先將其使用于轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸，發(fā)現(xiàn)可以提高轉(zhuǎn)染效率100倍以上2。因此，我們采用脂質(zhì)體 Lipofectin包裹PCNA反義寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，以求尋找

15、一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的轉(zhuǎn)染方法。本研究結(jié)果表明：在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，僅0.2mol/L濃度的反義 PCNA寡核苷酸即可在12小時(shí)內(nèi)完全抑制PCNA蛋白的表達(dá)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT法檢測(cè)，證實(shí)BIU-87細(xì)胞的增殖活性也受到了顯著抑制。而脂質(zhì)體介導(dǎo)正義寡核苷酸組則無此抑制作用，提示這種作用是序列特異性的，可能是通過PCNA反義寡核苷酸與PCNA mRNA特異性結(jié)合并激活RNaseH切割降解被結(jié)合的mRNA而實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，反義 PCNA寡核苷酸的抑制作用逐漸減弱。這可能是由于采用一次性給予寡核苷酸后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，寡核苷酸被細(xì)胞內(nèi)外 DNA酶消化，而PCNA mRNA又不斷轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所致。提

16、示多次給藥可能有助于維持反義寡核苷酸對(duì)PCNA的封閉效果。MTT檢測(cè)結(jié)果還表明，單純使用反義寡核苷酸至10mol/L時(shí)尚無明顯抑制細(xì)胞增殖作用，提示脂質(zhì)體提高轉(zhuǎn)染效率至少50倍以上。并且 MTT檢測(cè)和免疫組化法均顯示，單純脂質(zhì)體Lipofectin對(duì) BIU-87細(xì)胞的 PCNA表達(dá)和細(xì)胞增殖均無明顯影響。因此，脂質(zhì)體Lipofectin有可能作為一種低毒載體，用于介導(dǎo)反義寡核苷酸治療膀胱癌。本課題受吳階平基金資助（96-2-111)作者單位：曾甫清王同光朱朝暉趙軍劉博魯功成（430022 武漢，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院泌尿外科）參考文獻(xiàn)1Sakakura C,Hagiwara A,Tsuji

17、moto H,et al.Inhibition of gastric cancer cell proliferation by antisense oligonucleotides targeting the messenger RNA encoding proliferating cell nuclear antigen.Br J Cancer,1994,701060-1066.2Chiang MY,Chan H,Zounes MA,et al.Antisense oligonucleotides inhibit intercellular adhesion molecule 1 expression by two distinct mechanisms.J Bio Chem,1991,26618162-18171.3Travalis,Ku D,Rizzo MG,et al.Structure of the human gene for the proliferating cell nuclear antigen.J Bio Chem,1989,2647466-7472.4鄂征.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)