PTDeGFP△E250 mFoxp3融合蛋白的表達(dá)與穿膜能力鑒定

1、PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白的表達(dá)與穿膜能力鑒定         11-03-24 11:56:00     編輯：studa20           作者：藺昕 宗揚(yáng)勇 許遜 田雨香 陳勛 舒新軍 夏圣 王勝軍 許化溪 邵啟祥【摘要】  目的： 構(gòu)建、表達(dá)并純化含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTD）、eG

2、FP的小鼠Foxp3突變體（PTDeGFPE250 mFoxp3）融合蛋白，為研究小鼠Foxp3的功能奠定基礎(chǔ)。方法： 利用重疊延伸PCR方法構(gòu)建pET28aPTDeGFPE250 mFoxp3原核表達(dá)載體，并在大腸埃希菌Rosetta (DE3)中表達(dá)此融合蛋白，經(jīng)Ni2+柱純化，通過流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡觀察其穿膜效率。結(jié)果： 成功構(gòu)建了pET28aPTDeGFPE250 mFoxp3原核表達(dá)載體，并表達(dá)和純化了PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白，流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示融合蛋白能很好地穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。結(jié)論： 成功制備了具有穿膜

3、活性的PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白，為更好地研究小鼠Foxp3的功能與特性奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域； Foxp3； 突變； 穿細(xì)胞膜活性    Abstract  Objective: To express and purify a mutant mouse Foxp3 fusion protein containing a protein transduction domain from TAT and an enhanced green fluorescence protein (PTDeGFPE25

4、0 mFoxp3), furthermore to investigate itss efficiency and ability  transmembrane and laid the groundwork for future research  about the function of mouse foxp3.Methods： The pET28aPTDeGFPE250 mFoxp3 vector was constructed by inserting the PCR products of mouse mutant Foxp3 into pET28aPTDeGF

5、P vector. The fusion protein was expressed by E. coli Rosetta (DE3) and purified by BioRad Profinity IMAC Nicharged Resin. The efficiency and ability of transmembrane of PTDeGFPE250 mFoxp3 were detected by FCM and confirmed by confocal microscopy.  Results： The vector of pET28aPTDeGFPE250 mFoxp

6、3 was constructed correctly and the fusion protein was expressed and purified efficiently. The results of FCM and confocal microscopy investigation indicated that PTDeGFPE250 mFoxp3 fusion protein transduce into EL4 cell efficiently. Conclusion：  The PTDeGFPE250 mFoxp3 protein can transduce int

7、o cells efficiently and may be a useful tool to study the biological functions of Foxp3.    Key words  protein transduction domain；Foxp3；mutant；transmembrane ability    CD4+CD25hi調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg) 是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的成熟T細(xì)胞亞群，其通過抑制潛在的自身反應(yīng)性CD4+CD25-T細(xì)胞，而在自身免疫耐受

8、的形成、維持中發(fā)揮著重要的作用1。Foxp3(forkhead box P3 )屬于Fox轉(zhuǎn)錄因子家族成員，2001年由Brunkow等首次報(bào)道2。2003年Rudensky, Ramsdel和Hori等研究小組均證明Foxp3特異性表達(dá)于CD4+CD25hiT細(xì)胞中，是Treg細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白之一，且Foxp3很大程度上決定了Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能3-5。小鼠Foxp3蛋白結(jié)構(gòu)包括N末端富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，中間C2H2鋅指結(jié)構(gòu)和亮氨酸拉鏈，而叉頭狀DNA結(jié)合域靠近蛋白C末端6。在人類中研究顯示約70%發(fā)生嚴(yán)重的性聯(lián)多內(nèi)分泌腺和腸病變（immune dysregulation, polyen

9、docrinopathy, enteropathy, and Xlinked inheritance，IPEX）綜合征患者存在Foxp3突變，其中錯(cuò)義突變大多位于C末端叉頭DNA結(jié)合區(qū)域，也有少數(shù)存在于亮氨酸拉鏈以及N端富含脯氨酸的區(qū)域。研究顯示，發(fā)生在亮氨酸結(jié)構(gòu)域的缺失突變（E250）破壞了Foxp3的二聚化，并可影響Foxp3抑制功能的發(fā)揮7。    1988年Green和Franker分別發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type1，HIV1）編碼的反式激活蛋白（transactivator transcri

10、ption，TAT）具有獨(dú)特的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用，可以引導(dǎo)多種多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)8,9。1997年，Vives等10研究證明，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的是TAT中第47至57位的11個(gè)氨基酸殘基，該片段具有富含堿性氨基酸、帶較多正電荷的特點(diǎn)，其序列為：YCKRRKRQRRR，并把該片段稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTD）。PTD具有廣譜的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快，效率高，可以把分子量為20120 kDa的蛋白質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)11-13?；赑TD特有的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，我們利用重疊延伸PCR方法擴(kuò)增第250位谷氨酸缺失的Foxp3突變體（E250），將其插入pET28

11、aPTDeGFP載體中，構(gòu)建了PTDeGFPE250 mFoxp3表達(dá)質(zhì)粒，在大腸埃希菌中表達(dá)PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白，利用eGFP示蹤技術(shù)觀察融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞后的分布，并對(duì)其轉(zhuǎn)導(dǎo)活性和效率進(jìn)行了分析，為下一步的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。    1  材料與方法    1.1  材  料    大腸埃希菌株DH5，Rosetta（DE3）均由本室保存；EL4細(xì)胞為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部T細(xì)胞研究室陳慰峰院士贈(zèng)送，pET28aPTDeGFP和pET28aPTDFoxp3質(zhì)

12、粒由本室構(gòu)建。核酸電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、rTaq DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Hind，Xho和T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒購自上海捷瑞生物工程公司；氨芐西林、卡那霉素、IPTG購自南京建成生物公司；Profinity IMAC金屬螯合填料購自BioRad公司，PD10脫鹽預(yù)裝柱為美國GE公司產(chǎn)品。    1.2  儀  器    Nikon激光共聚焦顯微鏡，XL2020型超聲波破碎儀，F(xiàn)ASCaliber以及CellQu

13、est軟件（美國BD公司）    1.3  方  法    1.3.1  引物設(shè)計(jì)及合成  Foxp3突變體引物序列：根據(jù)基因庫中小鼠Foxp3基因序列和重疊延伸PCR的實(shí)驗(yàn)原理(圖1)，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，由上海生工生物公司合成：    引物A：CCCAAGCTTGCATGCCCAACCCTAGGCCAGCC (劃線處為Hind 酶切位點(diǎn))；    引物B：CCGCTCGAGTCAAGGGCAGGGATTGGAGCAC(劃線處為Xho酶切位

14、點(diǎn))。    引物C：GAAAAG (CTC) AAGCTGGGAGCTATGC（括號(hào)內(nèi)為定點(diǎn)缺失突變的堿基）；    引物D：AGCTCCCAGCTT(GAG)CTTTTCCAGC（括號(hào)內(nèi)為定點(diǎn)缺失突變的堿基）；    1.3.2  E250 mFoxp3突變體的擴(kuò)增  根據(jù)重疊延伸PCR的實(shí)驗(yàn)原理，分別進(jìn)行三步PCR反應(yīng)，以獲得E250 mFoxp3突變體產(chǎn)物。    如圖1所示，第一步PCR以構(gòu)建好的pET28aPTDFoxp3質(zhì)粒為模板，用引物A、

15、引物D進(jìn)行擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物AD；第二步PCR同樣以pET28aPTDFoxp3質(zhì)粒為模板，用引物B、C進(jìn)行擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物BC；最后以AD、BC產(chǎn)物為模板，用引物 A、引物B擴(kuò)增產(chǎn)物AB（E250 mFoxp3），上述PCR產(chǎn)物分別用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析鑒定。    圖1  重疊延伸PCR擴(kuò)增示意圖    Fig 1  The map of splicing by overlap extension PCR    1.3.3  E250 mFoxp3突變體產(chǎn)物的克隆

16、0; PCR大量擴(kuò)增E250 mFoxp3突變體產(chǎn)物，凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒回收目的基因，將目的基因連接到pMD18T載體上，16過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至預(yù)先制備好的大腸埃希菌感受態(tài)DH5，菌懸液均勻涂布在含氨芐西林（100 g/ml）的LB平板上，37培養(yǎng)過夜。    1.3.4  陽性克隆的篩選與鑒定  隨機(jī)挑取平板上的單個(gè)菌落，接種于含有氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，37振蕩培養(yǎng)過夜，用小量堿裂解法小量提取質(zhì)粒（命名為pMD18TE250 mFoxp3），分別以各質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒Hind ,Xho 雙酶切鑒定。&#

17、160;   1.3.5  序列測(cè)定與BLAST分析  將PCR鑒定和酶切鑒定正確的陽性質(zhì)粒送上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序，并在PubMed數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，確認(rèn)突變位點(diǎn)和其余序列的正確性。    1.3.6  PTDeGFPE250 mFoxp3原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建  分別將經(jīng)Hind 和Xho雙酶切pMDE250 mFoxp3的DNA片段和pET28PTDeGFP載體回收，以E250 mFoxp3與載體摩爾比31的比例，22連接過夜，構(gòu)建pET28aPTDeGFPE250 mFoxp3原核表達(dá)載體

18、。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至預(yù)先制備好的大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta（DE3）菌，菌懸液涂布在含有Kan（50 mg/ml）的LB平板上，37培養(yǎng)過夜。按照上面的方法進(jìn)行鑒定。    1.3.7  PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白的表達(dá)、鑒定與純化  將篩選出的陽性克隆菌接種于含有Kan（50 mg/ml）的LB培養(yǎng)液中37振搖過夜，次日按體積比為1100接種于含有Kan的新鮮LB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至D(600 nm)值為0.60.8，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，30和37分別誘導(dǎo)2，4，6，8 h，取1 ml菌液以12 000

19、 g，離心5 min，收集菌體，取少量加入100 l PBS混懸，取20 l混懸液與20 l的2×SDS上樣緩沖液混合后煮沸5 min，10 000 r/min離心10 min，進(jìn)行SDSPAGE分析。    其余細(xì)菌以含8 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液與菌體濕重之比為10 ml1 g加入結(jié)合緩沖液，冰浴中超聲10×15 s裂解，離心收集上清，加入含有1 ml Profinity IMAC金屬螯合填料的平衡柱，用含有10 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗滌，待流出液D(280 nm)趨近于0時(shí)，加入含有250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液，收集洗脫

20、液進(jìn)行SDSPAGE分析。收集的目的蛋白去鹽、過濾除菌后置-80保存。    1.3.8  流式細(xì)胞儀分析PTDeGFPE250 mFoxp3融合蛋白的穿膜能力和效率  EL4細(xì)胞培養(yǎng)在含10小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37，5CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，Hanks洗滌2次后，計(jì)數(shù)，按照5×105/孔接種于24孔板。每孔分別加入蛋白至濃度分別為625,1 250,1 875和2 500 nmol/L，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)2，4，6，8 h，收集細(xì)胞，4 1 500 r/min洗滌2次，最后加入500 l

21、PBS，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的eGFP熒光強(qiáng)度。    1.3.9  激光共聚焦顯微鏡觀察穿膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位  收集與640 nmol/L融合蛋白濃度共育2 h的細(xì)胞（5×105個(gè)/管），1 500 r/min離心10 min。預(yù)冷PBS洗2遍，加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定液，緩緩懸起細(xì)胞，固定30 min。離心去固定液，用PBS洗2遍。加入PI染色液（終濃度50 g/ml），緩緩懸起細(xì)胞，4避光染色30 min，PBS洗滌。加50 l PBS，重懸細(xì)胞并滴加至載玻片上，蓋上潔凈的蓋玻片，指甲油封片。共聚焦顯微鏡下觀察分析。    2  結(jié)  果    2.1  PCR擴(kuò)增E250 mFoxp3的結(jié)果    通過重疊延伸PCR，進(jìn)行三步P