大鼠局灶性腦缺血IL-8變化的研究

1、    大鼠局灶性腦缺血IL-8變化的研究        摘要：目的探討IL-8在腦缺血損傷中的變化。方法采用改良Zea Longa線栓法大鼠MCAO模型，將大腦中動(dòng)脈(MCA)閉塞不同的時(shí)間。應(yīng)用雙抗體夾心間接ELISA法檢測(cè)缺血組和對(duì)照組大鼠受傷腦組織及血清中IL-8濃度。結(jié)果閉塞3h缺血側(cè)半球濕重大于非缺血側(cè)(P<0.05)，并維持至48h；缺血組腦組織IL-8含量在MCA閉塞3h處于較低水平，隨后逐漸升高，至6h達(dá)高峰，隨后又降低；血清中IL-8含量在缺血3h達(dá)

2、高峰，隨后緩慢下降?？瞻捉M、假手術(shù)組腦組織內(nèi)IL-8含量高于缺血組(P<0.01)，同一大腦非損傷側(cè)高于損傷側(cè)。結(jié)論IL-8具有雙重作用，既參與腦組織的正常代謝及生理功能，又參與了腦缺血損傷的病理生理過程。關(guān)鍵詞：大鼠；腦缺血；細(xì)胞因子IL-8中分類號(hào)：R743文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1003-2754(2000)04-0221-03 The change of the level of interleukin-8 in focal cerebral ischemia in ratsCAO Qiu-yunPAN Xu-dong（Department of Neurology,The Af

3、filiated Hospital,Qingdao University Medical College,Qingdao 266003）Abstract:ObjectiveTo study the change of the level of interleukin-8(IL-8) in cerebral ischemia injury. MethodsThe middle cerebral artery (MCA) was occluded for different time with modified Zea Longa，s MCAO model. The level of IL-8 i

4、n injured brain tissue and blood serum was detected with double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,both in ischemia group and in control group. ResultsThe weight of the injured brain hemisphere is heavier than that of uninjured hemisphere from 3 hours to 48 hours after cerebral isch

5、emia(P<0.05). The content of IL-8 in injured brain tissue was in lower level at 3 hours after ischemia,and then increased,peaked at 6 hours,and then decreased. The concentration of IL-8 in serum peaked at 3 hours after ischemia,and then decreased slowly. The content of IL-8 in brain tissue of con

6、trol group was higher than that in ischemia group (P<0.01). ConclusionIL-8 has double roles it play a role in metabolism and function in normal brain tissue and a role in pathophysiological course of cerebral ischemia injury.Key words:Rat;Cerebral ischemia;Cytokine;IL-8白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)

7、是一種炎性趨化因子，對(duì)中性粒細(xì)胞具有趨化和激活作用。腦缺血損傷可產(chǎn)生完整的炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)。目前，細(xì)胞因子在腦缺血損傷中的作用已有不少報(bào)道，而IL-8在腦缺血損傷中的作用報(bào)道不多。作者就IL-8在腦缺血損傷中的作用進(jìn)行了探討。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年Wistar大鼠，清潔級(jí)，共56只，體重250±30g，雌雄不限，由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為：(1)空白組(n=8);(2)假手術(shù)對(duì)照組(n=8)；(3)缺血組：MCA分別閉塞3、6、12、24、48h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只。1.2栓線制備取4-0單股尼龍線50mm,直徑0.2mm，將頭端0.5mm加熱成光滑

8、球形，在光鏡下呈光滑圓球，于線端18.5mm處作標(biāo)記，75%酒精清潔后置肝素化生理鹽水中備用。1.3動(dòng)物模型制備將大鼠以3.6%水合氯醛(360mg/kg體重)腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，取頸部正中切口，鈍性分離甲狀腺，將其上翻并加以保護(hù)，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)，結(jié)扎ECA和CCA近心端，于CCA遠(yuǎn)心端備線，于ICA置一動(dòng)脈夾，參照改良Zea Longa方法1，2，于CCA近分叉處剪一約0.2mm的“V”字

9、形切口，插入栓線，插入深度18.5mm±0.5mm，使栓線進(jìn)入ICA，越過MCA開口處，到達(dá)大腦前動(dòng)脈(anterior cerebral artery,ACA)起始部，阻斷MCA的所有血液來源，扎緊備線，甲狀腺?gòu)?fù)位，關(guān)閉并縫合皮膚切口，栓線外留約1cm。缺血組大鼠將大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery,MCA)分別閉塞3、6、12、24、48h。假手術(shù)組手術(shù)過程同前，將栓線插入1min拔出。術(shù)中室溫保持在25，術(shù)后大鼠保溫。1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法1.4.1標(biāo)本收集每只模型成功的大鼠在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)過度麻醉，開胸暴露心臟、自右心房取血2ml，37.4孵育3小時(shí)，然后2

10、000r/min離心，分離血清，封存，置 -20 冰箱待測(cè)； 同時(shí)， 依次用 0.85%生理鹽水及4%多聚甲醛各200ml作心臟灌注，固定。斷頭取腦，用電子秤稱腦重量，分開兩半球，分別稱重，距額極2.5mm處向后切取2.5mm腦組織，稱重，按0.1g1ml的比例加4%多聚甲醛作腦組織勻漿，2000r/min離心，取上清，封存，置-20冰箱待測(cè)。1.4.2IL-8的測(cè)定IL-8的測(cè)定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，ELISA藥盒購(gòu)自美國(guó)Genzyme公司特許分裝的深圳晶美生物工程有限公司，由專人嚴(yán)重按藥盒說明書進(jìn)行操

11、作。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用PEMS 2.1軟件包行方差分析，q檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1腦缺血損傷后左右大腦半球重量比較，見表1。表1腦缺血左右大腦半球重量比較(±s,g)左半球右半球空白組假手術(shù)組缺血3h缺血6h缺血12h缺血24h缺血48h0.82±0.070.85±0.110.78±0.100.86±0.050.82±0.090.85±0.070.80±0.070.85±0.050.79±0.070.87±0.08*0.91±0.09*0.89±0.10*0.9

12、2±0.07*0.89±0.09*與左側(cè)大腦半球重量比較(采用配對(duì)t檢驗(yàn))，*P<0.05,*P<0.01 2.2腦缺血損傷后受損腦組織及血清IL-8含量變化，見表2。表2腦缺血后受損腦組織和血清IL-8含量變化(±s)腦組織(pg/g)血清(pg/ml)空白組假手術(shù)組缺血3h缺血6h缺血12h缺血24h缺血48h10.41±1.8312.83±3.214.58±1.37*6.19±1.25*5.78±1.80*5.72±1.47*4.13±0.74*1.56±0.371.

13、84±0.483.61±0.81*2.67±0.22*2.69±0.39*2.68±0.71*2.33±0.70*各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較*P<0.01 3討論3.1腦缺血后受損腦組織和血清中IL-8含量的改變呈時(shí)間依賴性。Liu等研究發(fā)現(xiàn)3，大鼠MCAO后6h，在缺血皮層可見CINC(cytokine-induced neutrophil chemoattractant,相當(dāng)于IL-8)mRNA升高，12h達(dá)高峰，24h后降低。原位雜交發(fā)現(xiàn)4，大鼠持續(xù)MCAO后15min有IL-1 mRNA的明顯表達(dá)，3h達(dá)高峰，4d內(nèi)逐漸消

14、失，1h出現(xiàn)TNF-mRNA的表達(dá)，612h達(dá)高峰，12d內(nèi)逐漸降低。IL-1和TNF-均為誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8的細(xì)胞因子5。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCAO后，MCA供血區(qū)腦組織IL-8含量，在3h處于較低水平，隨后逐漸上升，6h達(dá)高峰，然后緩慢下降。其產(chǎn)生晚于IL-1和TNF-。說明腦缺血后，能量的缺乏，興奮性氨基酸的釋放，致使鈣內(nèi)流、細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放，激活大量的酶，使氧自由基的產(chǎn)生增加，進(jìn)一步激活炎性細(xì)胞因子和IL-1和TNF-和TGF-等。IL-1和TNF等進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生使IL-8的水平增加。而TGF-可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-6，另外，尚有內(nèi)源性控制系統(tǒng)產(chǎn)生的細(xì)胞因子抑制，導(dǎo)致IL-8的水

15、平再度降低。3.2腦缺血時(shí)，腦細(xì)胞的無氧呼吸數(shù)分鐘，即由于儲(chǔ)備能量的耗竭而誘發(fā)酸中毒和能量型離子泵功能喪失。Na+-K+ATP酶的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙引起細(xì)胞腫脹和細(xì)胞毒性水腫。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺血3h，大腦半球重量損傷側(cè)開始大于非損傷側(cè)，大腦右半球重量開始大于左半球(P<0.05)，6h時(shí)明顯，持續(xù)到24h、48h后水腫程度減輕，仍重于左半球(P<0.05)，與腦組織IL-8含量變化時(shí)相基本一致。3.3IL-8被發(fā)現(xiàn)以來，一直以炎癥趨化因子的身份存在。很多作者認(rèn)為趨化細(xì)胞因子在正常細(xì)胞中不表達(dá)，通過研究認(rèn)為腦膠質(zhì)細(xì)胞可以表達(dá)CINC，在缺血6h出現(xiàn)過度表達(dá)，12h時(shí)達(dá)高峰。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，并設(shè)

16、空白對(duì)照組、假手術(shù)對(duì)照組及自身對(duì)照，發(fā)現(xiàn)空白組、假手術(shù)組腦組織內(nèi)IL-8含量高于腦缺血組(P<0.01)，腦缺血組非損傷側(cè)腦組織IL-8含量高于損傷側(cè)(P<0.05)。說明正常腦組織可以合成并釋放一定數(shù)量的IL-8。筆者認(rèn)為，正常腦組織IL-8含量高于受損腦組織，以及腦組織和血清中IL-8水平在腦缺血損傷中上升及下降的時(shí)相不一致表明，IL-8的產(chǎn)生及作用存在差異：其一為腦源性IL-8，參與正常腦組織的代謝和功能；其二為外周性IL-8，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)過程。以上結(jié)果可能是，正常腦組織產(chǎn)生一定量的IL-8，在缺血損傷的情況下，腦源性的IL-8產(chǎn)生

17、受到抑制，使受損區(qū)腦組織的IL-8含量驟然下降。隨后由缺血損傷導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，如IL-1、TNF- Et-17等，這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生IL-8，主要起炎癥趨化作用，吸引中性粒細(xì)胞到達(dá)損傷區(qū)，加重該區(qū)域的損傷。隨著炎癥的發(fā)展，調(diào)動(dòng)自身控制系統(tǒng)及細(xì)胞因子的抑制，致使炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的IL-8逐漸降低?？傊?，IL-8可能存在雙重作用，正常腦組織可以產(chǎn)生起生理作用的IL-8。腦缺血損傷后，炎癥反應(yīng)時(shí)可產(chǎn)生起炎性趨化作用的IL-8。所以，如果在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間給予對(duì)抗IL-8的藥物，抑制參與腦缺血損傷的IL-8，預(yù)計(jì)可以改善腦缺血損傷的預(yù)后。作者單位：曹秋云（青島

18、大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科，山東 青島 266003）潘旭東（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科，山東 青島 266003）參考文獻(xiàn)：1Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ. Stroke,1989,20:84-91.2王春霞，劉春風(fēng)，包士堯. 大鼠局灶腦缺血再灌注模型改良后的實(shí)驗(yàn)研究J. 蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，19：124-125.3Liu T,Young RP,Mc Donnell PC,et al. Cytokine-induced neurophil chemoattractant mRNA expressed in cerebral ischemiaJ. Neurosci Lett,1993,164:125-128.4Buttini M,Sauter A,Boddeke HW. Induction of interleukin-1 beta mRNA after focal cerebral ischemia in the ratJ. Brain Res M