微生物輔酶Q10高產菌株理性選育

1、微生物輔酶Q10高產菌株理性選育     摘要輔酶Q10是一種新型的生化藥物,常作為保健品、食品以及化妝品的添加劑,在醫(yī)藥和化妝品領域具有廣泛的應用前景。近年來,Q10的研究與開發(fā)越來越受國內外學者的關注。本文概述了微生物輔酶Q10合成代謝途徑、代謝定向育種等方面的研究進展。 關鍵詞輔酶Q10微生物理性育種 輔酶Q10(CoQ10)又稱為泛醌,為2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-二苯醌的側鏈帶有10個類異戊二烯的衍生物,在真核細胞內與線粒體內膜相結合,在原核細胞內則存在于細胞質膜中,是呼吸鏈的重要遞氫體1。它是細胞自身合成的天然抗氧化劑和細胞代謝的激活

2、劑,具有提高機體免疫力的功能,因而是一種臨床價值很高的生化藥物。它可用于治療心臟病、胃潰瘍、病毒性肝炎;還具有抗腫瘤、治療圓形脫發(fā)和肺氣腫的功能;對艾滋病和帕金森癥有顯著的輔助治療2。在化妝品和保健品市場中,輔酶Q10對延緩衰老和提高機體免疫力有著不可代替的作用3。隨著生活水平的提高,近年來人們對它的需求量不斷攀升,從而促進了輔酶Q10產品生物加工的發(fā)展 目前,輔酶Q10的生產主要依賴于微生物發(fā)酵法,受限于發(fā)酵的效價低,造成生產成本居高不下。本文主要對目前微生物輔酶Q10的研究現(xiàn)狀、高產菌株的選育思路以及發(fā)酵工藝控制方面進行概述,為大規(guī)模的工業(yè)化生產提供一定依據。 1微生物法生產輔酶Q10 輔

3、酶Q10的生產方法一般分為直接提取法、化學合成法、微生物發(fā)酵法等。直接提取法受到原材料輔酶Q10含量的限制且受原料及季節(jié)等的限制,提取成本高,不適合于現(xiàn)代化工業(yè)大生產?；瘜W合成法制得輔酶Q10為順反異構體混合物,生物活性低,同時合成過程反應復雜、步驟多、且轉化效率低、往往還存在許多副產物,這些因素都嚴重影響了其產業(yè)化的發(fā)展4。 微生物發(fā)酵法是目前生產輔酶Q10的最主要生產方法。該生產方法由于原料廉價豐富,產物分離過程相對簡單,產物為天然品,不存在手性問題,生物活性好,易被人體吸收,且可以通過發(fā)酵罐實現(xiàn)規(guī)?；I(yè)化生產,因此成為最有發(fā)展?jié)摿Φ妮o酶Q10生產方法。迄今為止,國內外報道的輔酶Q10產

4、生菌大多為細菌5-8,表1列出主要的產輔酶Q10微生物。通常微生物發(fā)酵產生輔酶Q10的產量在30130mg/L,據估計要實現(xiàn)商業(yè)化生產輔酶Q10的產量應該高于500mg/L9。日本是最早開發(fā)輔酶Q10的國家,但從近幾年的發(fā)展趨勢來看,中國正成為輔酶Q10原料藥的生產中心。 2輔酶Q10高產菌株選育策略 2.1 應用代謝調節(jié)理論推理選育高產菌 在對輔酶Q10生物合成途徑及其調控機制研究基礎上,利用代謝工程的定向選育高產菌株,優(yōu)化代謝途徑,可達到提高輔酶Q10發(fā)酵水平的目標。目前主要代謝控制策略:(1)強化輔酶Q10組件的生物合成,即強化莽草酸途徑、MEP途徑與甲硫氮酸合成途徑;(2)切斷或減弱支

5、路通量,解除其末端產物對輔酶Q10代謝流的分流與反饋抑制,例如莽草酸途徑也產生芳香族氨基酸、類胡蘿卜素等;(3)強化葡萄糖代謝流量,解除葡萄糖分解代謝阻遏,實現(xiàn)高濃、高效轉化。 表1輔酶Q10主要產生菌 菌株 CoQ10濃度mg.L-1 CoQ10含量mg/g-DCW 參考文獻 煙曲霉Aspergillus fumigatus 37.8 4.2 (7) 莢膜紅細菌Rb. capsulatus - 5.3 (11) 類球紅細菌Rb.sphaeroides 97.2 2.7 (10) 類球紅細菌Rb.sphaeroides突變株Co-22-11 350 8.7 (9) 根癌農桿菌Agrobacte

6、rium tumefaciens 87.6 8.5 (6) 放射型土壤桿菌Agrobacterium radiobacter 60.0 - (9) 脫氮副球菌Paracoccus denitrificans 27.6 0.86 (9) *通訊作者:鄭毅。 2.1.1選育營養(yǎng)缺陷型突變株 Olson和 Rudney12發(fā)現(xiàn)胡蘿卜素合成和輔酶Q10合成具有共同的前體,胡蘿卜素分支是輔酶Q10合成中的一股強大的代謝流。胡蘿卜缺陷型菌株可以切斷-胡蘿卜素的代謝流,從而增加與輔酶Q10合成的共同前體GGPP的積累與供給,提高輔酶Q10的產量。Hajime Yoshida等9獲得R. sphaeroide

7、s綠色突變株的Q10胞內含量比野生型提高3.6倍。研究表明,通過選育L-苯丙氨酸缺陷、蘇氨酸、L-酪氨酸缺陷或色氨酸缺陷等營養(yǎng)缺陷型突變株以阻斷不必要的代謝支路,增加甲硫氨酸和SAM合成途徑中各酶基因尤其是限速酶的拷貝數(shù)及表達量,可以提高SAM的產量,為合成輔酶Q10提供富足的前體14。 2.1.2選育抗反饋調節(jié)的突變株 (1)耐前體突變株選育 在輔酶Q10生物合成的中,每合成一分子產物需要一分子對羥基苯甲酸(PHBA),一分子聚異戊二烯焦磷酸(PPP),還需要S-腺苷蛋氨酸(SAM)和O2的供給,因此要提高輔酶Q10產量必須保證前體的協(xié)同供給。L-乙基硫氨酸是L-蛋氨酸的結構類似物,因此選育

8、抗前體L-乙基硫氨酸突變株,可以解除蛋氨酸對高絲氨酸轉乙?；傅姆答佉种坪蛯﹄琢蛎蚜呀饷负娃D甲基酶的阻礙,有利于輔酶Q10的大量積累。王普等15,對實驗室自行篩選的輔酶Q10 產生菌株季也蒙假絲酵母( Candida guilliermind) CG108進行誘變,并結合L-乙基硫氨酸耐前體突變株的理性化篩選,獲得一株輔酶Q10高產菌株PN251。 (2)耐終產物突變株選育 選育抗類似物突變株是目前代謝控制育種的主要方向16。在輔酶Q10的合成途徑中,終產物可能抑制產物的大量合成。Vk3是輔酶Q10的結構類似物,因此利用類似于Vk3等輔酶Q10結構類似物來遺傳性的解除對代謝關鍵酶的抑制作用,使

9、得在細胞中已經有大量終產物的情況下仍能不斷合成所需產物。張向陽等17,以根癌土壤桿菌( A. tumef - aciens) 突變株WSH2E01為出發(fā)菌株,通過進一步的誘變處理,獲得L-乙硫氨酸和維生素K3 (VK3 ) 雙抗性突變株WSH2V01,與出發(fā)菌株WSH AT12 相比,突變株WSH2V01 在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下輔酶Q10 產量達到29. 5 mg/L 。 (3)解除葡萄糖分解阻遏突變株 當發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度提高到一定濃度時,會抑制菌體的生長與產物生成,這可能是由于某些酶的合成被容易分解利用的碳源所阻遏。因此選育解除葡萄糖分解阻遏突變株,增加葡萄糖代謝通量,從而促進了輔酶Q1

10、0的合成。 2.1.3 應用細胞毒性物質篩選高產菌株 在培養(yǎng)基中添加放線菌素D、羅紅霉素等細胞毒性物質對菌體細胞產生脅迫毒害作用。由于輔酶Q10是一種能提高機體免疫力的生理活性物質,篩選抗細胞毒性物質的菌株,可以獲得高產輔酶Q10的菌株。此篩選模型大大加快了高產菌株的選育過程。潘春梅等18,以放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)WSH2601為出發(fā)菌株,經紫外線和亞硝基胍復合誘變,獲得遺傳穩(wěn)定性好的抗放線菌素D突變株WSH-F06。 在輔酶Q10的選育過程中,僅選用單一的一種育種策略是遠遠不夠的。通常情況是基于廣譜性的選育手段(如通過紫外處理、輻射處理、細胞毒性物質等19

11、),再結合針對輔酶Q10某些合成途徑設計的選育模型進行復合育種,從而獲得輔酶Q10高產菌株。 2.2 應用代謝工程理論構建輔酶Q10工程菌 利用基因工程理論改變細胞內代謝調節(jié)機制也是獲得高產菌種的一個重要策略。 2.2.1莽草酸途徑及代謝工程育種 基于對大腸桿菌代謝途徑的不斷探索和深刻認識,以及菌體自身的優(yōu)良條件,目前對其進行基因工程改造較為成功20。在大腸桿菌中,通過提高輔酶Q10合成途徑中ubi基因的表達可以提高輔酶Q10前體的流通量,從而獲得大量的終產物。Barker21等通過選擇性地表達莽草酸途徑中的幾個酶,同時限制芳香族氨基酸的通量,使對羥基苯甲酸的產量達到了12g/L。 2.2.2

12、聚異戊二烯焦磷酸合成(PPP)途徑及代謝工程育種 由于大腸桿菌主要是合成輔酶Q8,而通過基因工程原理改造輔酶Q10異戊二烯側鏈聚合的關鍵酶,從而使其大量合成輔酶Q10。Cheong等22將聚十異戊二烯焦磷酸(DPS ) 基因和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因一起插入載體pGPRX11中,通過質粒轉化入Agrobacterium tumefaciens BNQ-pGPRX11-(KCCM-10554)中表達,得到輔酶Q10的高產菌,通過發(fā)酵工藝優(yōu)化后產率達到6.69 mg/ g,工業(yè)化生產前景較好。 2.2.3甲基引入策略 大腸桿菌中,芳香環(huán)修飾的第一步是PHBA和PPP的縮合

13、反應,催化此反應的酶是對羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉移酶(UbiA),此酶為膜結合蛋白,是生物輔酶Q10合成的限速步驟12。過量表達UbiA等相關基因可以使輔酶Q10的產量提高。 運用基因工程原理進行育種選育高產菌株可以獲得較好的效果,但是由于輔酶Q10代謝合成路徑復雜,所涉及到的基因繁多,研究工作較為緩慢,因此,還需要進一步的深入研究。 3展望 隨著輔酶Q10的需求量不斷攀升,越來越多國內外學者加入到研究輔酶Q10的行列。國外學者在利用基因工程改造菌種方面以及發(fā)酵過程中的條件控制方面做了許多研究。國內的研究主要側重于利用傳統(tǒng)的誘變育種進行菌種選育以及配方優(yōu)化方面,盡管獲得了一系列產量提高的突

14、變株,但總體產量水平還達不到工業(yè)化生產的水平。隨著輔酶Q10生物合成途徑及調控機制的深入研究,應用代謝工程的方法選育高產菌株,構建工程菌株,改造原菌株,從而進一步化化生產工藝。同時,輔酶Q10發(fā)酵過程中的工藝參數(shù)控制相對復雜,如何簡化發(fā)酵工藝控制的中間環(huán)節(jié),建立自動化控制模式也是十分重要的。 www.lunwen.us論文發(fā)表參考文獻: 1 張繼中,遲莉麗,沈亞領. 輔酶Q10的生產及在醫(yī)學領域中的應用J.上海應用技術學院學報,2004,12,4(4):301-305. 2 楊學義,宿燕崗.輔酶Q10的藥理和臨床應用J.中國藥理學通報,1994,10(2):88-91. 3 胡淼琳.Coenz

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