強(qiáng)力霉素對(duì)移植肺缺血-再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的研究(1)

1、強(qiáng)力霉素對(duì)移植肺缺血-再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的研究(1)】 目的 探討外源性基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)抑制劑強(qiáng)力霉素在移植肺缺血-再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響。 方法 建立大鼠自體左肺肺缺血再灌注模型，16只SD受體大鼠隨機(jī)分為兩組:缺血再灌注組和強(qiáng)力霉素組，用免疫組化方法觀察移植肺Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)情況，并取肺組織平滑肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用熒光技術(shù)測(cè)定肺組織細(xì)胞凋亡。結(jié)果 肺缺血再灌注后，與對(duì)照組相比，強(qiáng)力霉素組移植肺Bax和Caspase-3表達(dá)明顯降低(P0.05)，但Bcl-2/Bax比例升高；熒光圖片顯示，強(qiáng)力霉

2、素組的細(xì)胞凋亡明顯較對(duì)照組減少。結(jié)論 強(qiáng)力霉素可能通過(guò)下調(diào)Bax、Caspase-3表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比例而抑制肺缺血再灌注損傷的細(xì)胞凋亡，并通過(guò)降低基底膜的降解，減輕肺水腫，達(dá)到肺保護(hù)作用。【關(guān)鍵詞】 肺；缺血-再灌注損傷；強(qiáng)力霉素【Abstract】 Objective To investigate the effect of exogenous matrix metalloproteinase inhibitor on pneumocyte apoptosis in lung ischemia-reperfusion injury and the mechanism. Meth

3、ods Models of ischemia-reperfusion lung injury in SD rats were randomly divided into two groups. The protein level expression of Bcl-2 、Bax and Caspase-3 was measured by immunohistochemistry methods after 2h transplantation. Apoptotic morphological changes were assayed with Hoechst 33258 staining an

4、d were observed under fluorescent microscope. Results The protein level expression of Bax and Caspase-3 was significantly decreased in doxycycline group than in control group (P0.01)， the expression of Bcl-2 was not significantly increased in doxycycline group， but the ratio of Bcl-2/ Bax was signif

5、icantly increased in doxycycline group (P0.01). After treatment with MMPs inhibitor， PMVECs apoptosis decreased significant. Conclusions Doxycycline can suppress apoptosis and protect lung tissue cell in the lung ischemia-reperfusion injury.肺移植作為治療多種終末期肺疾病的有效方法，于1983年在臨床上首次獲得成功。但越來(lái)越多的證據(jù)顯示，供肺/移植肺仍然易于

6、受到保存損傷(缺血)和再灌注損傷，導(dǎo)致移植后早期嚴(yán)重移植肺功能不全的發(fā)生率高達(dá)20%，移植受者術(shù)后ICU監(jiān)護(hù)時(shí)間延長(zhǎng)，術(shù)后早期死亡率增加1，并與移植后晚期較高的閉塞性支氣管炎（obliterative bronchitis，OB）發(fā)生率相關(guān)。因此，研究低溫肺保存后再灌注損傷的機(jī)制，改善移植肺功能，仍然是肺移植領(lǐng)域中所急需解決的重點(diǎn)課題之一。眾多研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是肺缺血再灌注損傷的重表現(xiàn)形式。細(xì)胞凋亡受多種因素的調(diào)控，尤其是凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax和凋亡執(zhí)行基因Caspase-32，3。本研究旨在通過(guò)建立大鼠自體左肺肺缺血再灌注模型移植模型，探討外源性基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix m

7、etalloproteinases，MMPs)抑制劑強(qiáng)力霉素在移植肺缺血-再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)分組、模型建立和取樣1.1.1 實(shí)驗(yàn)分組 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠16只(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重250340g，隨機(jī)分為兩組：A組（n=8）：缺血 （IR）組，大鼠左肺經(jīng)歷原位熱缺血30min、冷缺血3h、熱缺血30min和不同時(shí)間的再灌注處理；B 組（n=8）：治療組，術(shù)前一次性灌胃，連續(xù)7天，缺血90min，再灌2h于左肺門開(kāi)放前10min經(jīng)頸靜脈注入強(qiáng)力霉素30mg/(kgd)，其余操作同IR組。A組和B組給予等體積的生理鹽水

8、。1.1.2 大鼠自體左肺模擬原位移植模型的建立 術(shù)前30min肌注阿托品（0.5mg/kg），30g/L的戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔內(nèi)注射，麻醉成功后，將大鼠右側(cè)斜位固定于手術(shù)臺(tái)上。氣管切開(kāi)插管連接微型動(dòng)物呼吸機(jī)。輔助呼吸參數(shù)為：潮氣量10ml/kg，呼吸頻率75次/min，吸入氧濃度FiO21.0，呼氣末正壓2.0cmH2O。右側(cè)頸動(dòng)脈插管，用于采集標(biāo)本、監(jiān)測(cè)血壓；右側(cè)頸靜脈穿刺備用；尾靜脈微量注射泵持續(xù)補(bǔ)液，速度為4.0ml/(kgh)。經(jīng)左第5肋間前外側(cè)切口進(jìn)胸并橫斷胸骨，打開(kāi)縱隔。頸靜脈注射肝素鈉（375.U/kg）后，剝離左肺門，離斷左下肺韌帶；經(jīng)左向右游離右肺動(dòng)脈、靜脈及主支氣

9、管，預(yù)置阻斷帶。然后用一塑料袋（內(nèi)徑約2.5cm）套住左全肺，并在肺門處形成反折，連同塑料袋一起用無(wú)創(chuàng)傷鉗于吸氣末阻斷左肺門根部1，2，此時(shí)潮氣量減至8.0ml/kg，呼吸頻率100次/min，其他參數(shù)不變。30min后，在反折的塑料袋加入冷生理鹽水及小冰塊，把套有塑料袋的左肺上提至切口平面（勿與周圍臟器接觸）。袋內(nèi)置一溫度計(jì)使之保持在4左右。冷缺血3h后去除冷鹽水，使左肺又轉(zhuǎn)變?yōu)闊崛毖?30min后松開(kāi)無(wú)創(chuàng)傷鉗，形成再灌注。同時(shí)頸靜脈給予魚(yú)精蛋白（2.43.0mg/kg）。待血壓、呼吸穩(wěn)定后（肉眼上，左肺變得紅潤(rùn)，約需10min），夾閉右肺門，形成左單肺再灌注。1.1.3 大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞

10、（PMVECs）的培養(yǎng)與鑒定 聯(lián)合應(yīng)用鹽酸氯氨酮(20mg/kg)和安定(2mg/kg)麻醉，開(kāi)胸在左心室剪一小口，從右心室注入20ml D-Hanks液(在1L去離子水中加入0.4gKCl，0.06g KH2PO4，8.0g NaCl，0.35g NaHCO3，0.08g Na2HPO412H2O，0.01g酚紅調(diào)pH 7.2)灌注心臟，使肺臟充盈變白。D-Hanks液中漂洗肺臟后，在0.1%胰酶/0.1鞹A中37消化15min，以除去上皮細(xì)胞，再以DMEM漂洗2次，小心剪取肺組織邊緣約23mm的組織并剪成1mm1mm1.5mm的小塊，加入12滴胎牛血清，接種到T25的培養(yǎng)瓶中，37CO2孵

11、箱中放置30min，加入6ml含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。1.2 檢測(cè)指標(biāo)1.2.1 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平變化 移植術(shù)后2h每組取移植肺，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平變化。采用SABC免疫組織化學(xué)方法。采用HMIAS-1000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，進(jìn)行圖像灰度變換，使染色陽(yáng)性面積與背景分開(kāi)，并自動(dòng)測(cè)量染色陽(yáng)性面積。每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野，5個(gè)視野面積作為包容空間（或參考空間），將上述檢測(cè)分子的陽(yáng)性面積除以包容空間，取其均值（%）作為“陽(yáng)性區(qū)域面積”。【摘】目的探討外源性基質(zhì)金屬蛋白酶(ma

12、trix metalloproteinases， MMPs)抑制劑強(qiáng)力霉素在移植肺缺血-再灌注 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。1.2.2 細(xì)胞凋亡的熒光Hoechst33258染色 細(xì)胞凋亡的熒光Hoechst33258染色，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4105，離心棄上清液，細(xì)胞懸浮于100l DMEM培養(yǎng)基后，加入20l的0.5mg/ml Hoechst33258儲(chǔ)存液，室溫放置10min，熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞并拍片。1.3

13、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平變化 與對(duì)照組相比，強(qiáng)力霉素組Bax和Caspase-3表達(dá)明顯降低(P0.01)，Bcl-2表達(dá)無(wú)明顯增高(P0.05)（表1）。表1 各組Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)（%） (xs，n=8)注:vs Con*P0.012.2 細(xì)胞核形態(tài)的Hoechst 33258熒光染色 Hoechst 33258 是與 DNA 特異結(jié)合的藍(lán)色熒光染料經(jīng)熒光顯微鏡觀察， 經(jīng)強(qiáng)力霉素對(duì)照組的細(xì)

14、胞核呈現(xiàn)均勻的紅色熒光，其細(xì)胞核邊界規(guī)則整齊，染色質(zhì)均勻分布(圖 1)，對(duì)照組的PMVECs 細(xì)胞核則出現(xiàn)不均勻亮度的藍(lán)色熒光， 細(xì)胞核先后呈現(xiàn)凋亡早期(波紋狀)、中期(核染色質(zhì)凝聚， 邊緣化)和晚期(核裂解， 產(chǎn)生凋亡小體)的典型變化，其凋亡的細(xì)胞主是肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞(圖2)。 3 討論缺血再灌注損傷是肺移植后早期出現(xiàn)原發(fā)性移植物功能不全（primary graft failure，PGF）的主原因，臨床主表現(xiàn)為進(jìn)行性的低氧血癥，肺順應(yīng)性降低，毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致肺水腫，在X線胸片上表現(xiàn)為廣泛的肺泡密度增高影2。此外，IR可引發(fā)早期的排斥反應(yīng)，并與移植后晚期較高的閉塞性支氣管炎（OB

15、）發(fā)生率相關(guān)4。因此開(kāi)展移植肺IR損傷的研究對(duì)肺移植的成敗顯得尤為重。凋亡是以DNA發(fā)生特異性的片段化斷裂，形態(tài)上表現(xiàn)為核固縮、胞膜內(nèi)陷、皺縮、包裹胞質(zhì)形成凋亡小體為特征，受特定的基因調(diào)控。Fischer及Stammberger等都曾提出凋亡為肺缺血再灌注損傷的早期事件5，6。雖然肺缺血再灌注損傷時(shí)產(chǎn)生的自由基、細(xì)胞因子等是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素，但這些因素并不直接引起細(xì)胞凋亡，而是通過(guò)一定的信號(hào)傳遞方式激活生存與死亡的相關(guān)基因(如Bcl-2、Bax、p53等)，然后將信號(hào)傳遞到核內(nèi)切酶，激活Caspase-3執(zhí)行死亡功能。其中Bcl-2和Bax是兩個(gè)重的相關(guān)基因，前者抑制細(xì)胞凋亡，而后者促進(jìn)

16、細(xì)胞凋亡，并且Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的比例是決定細(xì)胞凋亡與否的關(guān)鍵7。本實(shí)驗(yàn)也證明，再灌注后肺組織細(xì)胞凋亡明顯增加，參與肺損傷作用。強(qiáng)力霉素能抑制在體肺缺血再灌注損傷中血管內(nèi)皮細(xì)胞Bax 和Caspase-3表達(dá)，對(duì)Bcl-2的表達(dá)無(wú)明顯影響，但Bcl-2/Bax的比例明顯提高，從而發(fā)揮抗肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。缺血-再灌注的損傷機(jī)制雖很復(fù)雜，但微血管完整性被破壞是其損傷的中心環(huán)節(jié)8。血管基底膜是控制微血管通透性的最重的結(jié)構(gòu)。外源性基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs ）是一類以Zn2 為輔助因子的蛋白酶家族，其中MMP-2和MMP-9能降解肺毛

17、細(xì)血管基底膜的基質(zhì)成分，與微血管完整性密切相關(guān)9。生理?xiàng)l件下，大鼠肺組織能表達(dá)低水平的proMMP-2及活性MMP-2、proMMP-9，幾乎不表達(dá)活性MMP-910。缺血、缺氧條件下能夠誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等分泌MMPs；同時(shí)缺血-再灌注誘發(fā)炎癥反應(yīng)，此時(shí)，炎性細(xì)胞成為MMPs的重來(lái)源。強(qiáng)力霉素是四環(huán)素類抗生素的一種，大量研究顯示四環(huán)素類及它們經(jīng)化學(xué)改良、非抗生素類似物是一類廣譜的MMP抑制劑。其參與肺缺血再灌注損傷的可能機(jī)制表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面11：(1)抑制肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡；(2)通過(guò)清除其他細(xì)胞產(chǎn)生的反應(yīng)性氯化物阻止MMP酶原的激活；(3)抑制其他膠原溶酶（如溶酶體酶、組織蛋

18、白酶）；(4)減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)至肺間質(zhì)，抑制中性粒細(xì)胞脫顆粒。其機(jī)理有待進(jìn)一步探討。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，缺血-再灌注肺損傷中，強(qiáng)力霉素通過(guò)抑制MMPs的分泌及激活，降低基底膜的降解，減輕肺水腫及炎癥反應(yīng)， 抑制肺組織細(xì)胞凋亡，達(dá)到肺保護(hù)作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Thabut G，Vinatier I，stern JB，et al. Primary graft failure following lung transplantation: predictive factors of mortality. Chest，2002，121(6):1876-1882.2 Budijardjo L，Oliver

19、 H，Lutter M，et al. Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis. Annu Rev Cell Dev Biol，1999，15:269-290.3 Kroemer G，Reed JC. Mitochondrial control of cell death. Nature Med，2000，6:513-519.4 Fiser SM，Tribble CG，Long Sal. Ischemia-reperfusion injury after lung transplantation increases

20、risk of late bronchiolitis obliterans syndrome. Ann Thorac Surg，2002，73(4):1041-1047.5 Fischer S，Maclean AA，Liu M et al. Dynamic changes in apoptotic and necrotic cell death correlate with severity of ischemia-reperfusion injury in lung transplantation.Am J Respir Crit Care Med，2000，162(5):19321939.

21、6 StammbergerU，GaspertA，Hileinger S，et al. Apoptosis induced by ischemia and reperfusion in experimental lung transplantation. Ann Thorac Surg，2000，69(5): 15321536.7 Green DR，Reed JC. Mitochondrial and apoptosis . Science，1998，281:1309-13128 Sute PM，Suter S，Girardin E，et al. High bronchoalveolar levels of tumor necrosis factor and its inhibitors， interleukin-I，interferon ，and elastase in patients with adult respiratory syndrome after trauma ，shock ，or sepsis. Am Rev