造血干細胞的提取

1、造血細胞分離、集落培養(yǎng)及表型分析所謂造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一類細胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即經(jīng)過一個細胞周期活動之后，可以產(chǎn)生兩個與分裂前性質(zhì)相同的造血干細胞,同時又具有多向分化能力，即在一定的環(huán)境條件下，造血干細胞具有向各系血細胞分化的能力。圖1 造血系統(tǒng)和造血干細胞分化圖Fig。 1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation. 造血干細胞主要存在于骨髓、動員的外周血、臍血中，與骨髓和動員的外周血相比，臍血來源豐富

2、、受病毒污染的幾率小、富含造血干細胞且所含的造血干細胞具有更高的增殖潛能，同時臍血中的淋巴細胞幼稚，具有較低的免疫排斥活性，是優(yōu)良的造血干細胞來源。造血干/祖細胞鑒別的傳統(tǒng)方法還是應(yīng)用集落分析方法，它可檢測粒-巨嗜細胞集落形成單位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、紅系爆式集落形成單位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核細胞集落形成單位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、紅系-粒系-巨嗜系-單核系集落形成單位（multipoten

3、t colony-forming units，CFU-GEMM或mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天，然后在顯微鏡下計數(shù)集落。造血干細胞的表面標志隨著個體發(fā)育的不同時期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已經(jīng)普遍被認為是造血干細胞的標志。此外，1997年發(fā)現(xiàn)一個新的造血干細胞標志是AC133，但具CD34抗原是目前公認的造血干細胞和祖細胞的共同標志。一、實驗原理1、用流式細胞儀分析細胞表型待測細胞被制成單細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后加

4、入樣品管中，在氣體壓力推動下進入流動室，流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排成單列出流動室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細胞液柱。這種同軸流動的設(shè)計，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種分層鞘流的狀態(tài)。鞘液和樣品流組成一個圓形的流束，一起自噴嘴的圓形寶石孔噴射出來，進入流動室，與水平方向的激光光束垂直相交。該區(qū)稱為測量區(qū)。利用樣品流和鞘流的氣壓差的層流原理，使細胞依次排列成單行，每個細胞以均等的時間依次通過測量區(qū)，被熒光染料染色的細胞受到強烈的激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生散射光。細胞發(fā)出的熒光信號和散射光信號，同時被熒光光電倍增管接收，被積分放大反轉(zhuǎn)換為電子信號輸入電子信息接收器、通過計算

5、機快速而精確地將所測數(shù)據(jù)計算出來，結(jié)合多參數(shù)分析，從而實現(xiàn)了細胞的定量分析。2、單個核細胞的分離采用密度梯度原理，利用血液中各類細胞的密度不同進行分離。3、CD34+細胞分選利用抗原抗體反應(yīng)的原理，樣品中的CD34+細胞可與偶聯(lián)有CD34抗原的磁珠反應(yīng)，將MiniMACS 免疫磁性吸附柱置于磁場中，未與磁珠結(jié)合的CD34-細胞隨緩沖液流出，與磁珠結(jié)合的CD34細胞保留在吸附柱中，將吸附柱移出磁場后用MACS緩沖液沖洗吸附柱即獲得純化的CD34細胞。4、集落檢測利用造血干細胞的特性，在特定的條件下，造血干細胞可向某一系的細胞分化，從而在半固體培養(yǎng)基上形成一個個的克隆，即集落，一個集落代表一個造血

6、干/祖細胞。二、實驗材料臍血 臍血由上海國際和平婦嬰保健院提供。供者要求身體健康，發(fā)育良好的非高齡產(chǎn)婦。無遺傳病史，無病毒病史，無血液系統(tǒng)疾病，無寄生蟲病及地方病。HIV、肝炎、梅毒等檢測均為陰性。健康產(chǎn)婦分娩以后，立即用血袋無菌采取新生兒臍帶血，血袋內(nèi)裝有無菌ACDB25mL抗凝劑(每100mLACDB含有：一水合枸櫞酸0.48g，二水合枸櫞酸鈉1.32g，一水合葡萄糖1.47g)，相當于100mL的血液抗凝劑，每次實際采集臍帶血50-100mL。采集后臍帶血置于4冰箱內(nèi)保存，一般在6小時內(nèi)取回分離。培養(yǎng)基與細胞因子培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基，添加20%的胎牛血清。細胞因子均為人重組蛋白，干細胞

7、因子（SCF）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-3（IL-3）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、紅細胞生成素（EPO）、三、實驗方法 單個核細胞的Ficoll密度梯度離心分離將臍血用IMDM培養(yǎng)基以1：2稀釋，在50mL離心管中加入15mL Ficoll，之后小心加入30mL稀釋的臍血平鋪在Ficoll上，之后置于吊籃式離心機中在400g下密度梯度離心30min，吸取中間的白層，用IMDM培養(yǎng)基洗滌細胞，除去淋巴細胞分離液和血小板。集落分析方法CFUGM的檢測體系為IMDM培養(yǎng)基，添加20胎牛血清，4mmol/mL谷氨酰胺，含0.9甲基纖

8、維素，以及人重組造血生長因子SCF、IL-3、IL-6，GMCSF、GCSF,其濃度分別為50 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL和20ng/mL。半固體培養(yǎng)在24孔板中進行，每孔加半固體培養(yǎng)基500mL，加入2.5104個單個核細胞。在37、5CO2、濕度飽和的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天后在顯微鏡下進行集落計數(shù)，超過50個細胞的細胞簇為一個集落。 流式細胞分析取1.0106細胞用PBS洗兩遍，重懸后分配到1.5mL管中離心，加PE偶聯(lián)的小鼠抗人CD34單抗和FITC偶聯(lián)的小鼠抗人CD45單抗各10mL，4孵育30分鐘。PBS洗兩遍，離心后，每管加1mL FACS

9、保存液。同型對照以PE偶聯(lián)的小鼠抗真菌毒素標記。標記細胞用流式細胞儀（BD公司）分析，結(jié)果用Lysis II軟件處理，以CD45設(shè)門進行分析。臍血CD34細胞的分離純化將1.0108細胞懸浮于0.3mlMACS緩沖液中，加 50l偶聯(lián)于磁珠的小鼠抗人CD34+抗體，4孵育30分鐘，采用MiniMACS 免疫磁性吸附柱分離裝置洗滌吸附柱中進行分離，未與磁珠結(jié)合的CD34-細胞隨緩沖液流出，與磁珠結(jié)合的CD34細胞保留在吸附柱中，將吸附柱移出磁場后用MACS緩沖液沖洗吸附柱即獲得純化的CD34細胞。四、實驗結(jié)果1、單個核細胞的分離臍血的體積臍血中單個核細胞液體積分離出的單個核細胞液的密度分離出的單

10、個核細胞液的體積收率樣品12.540ml樣品21.2540ml2、造血干/祖細胞集落計數(shù)孔內(nèi)接種的單個核細胞數(shù)目孔內(nèi)的集落數(shù)每10000個細胞中集落的數(shù)目一袋臍血中總集落數(shù)樣品12.543樣品22.5313、臍血中CD34+細胞的數(shù)量CD34+細胞的比例一袋臍血中CD34+細胞的總數(shù)樣品1樣品24、臍血中分離得到的CD34+細胞的數(shù)量CD34+細胞的數(shù)目樣品1樣品2五、討論1、從一袋血獲得的CD34+細胞數(shù)與集落形成數(shù)之間有和關(guān)聯(lián)？2、用MiniMACS 免疫磁性吸附柱分離法獲得的CD34+細胞數(shù)，與流式細胞分析的結(jié)果是否一致？若不一致，原因何在？動物細胞培養(yǎng)、計數(shù)、冷凍和復蘇I. 動物細胞的

11、培養(yǎng)和計數(shù)一、 實驗?zāi)康挠蓜游锛毎磉_和合成的蛋白質(zhì)除了具有正確的氨基酸序列之外，在加工過程中還能以正確的方式進行折疊和修飾，且大多能以天然形式分泌到培養(yǎng)基中，從而確保了所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)具有與天然產(chǎn)物一致的生物活性、免疫原性和體內(nèi)壽命，這些特點使得動物細胞成為工業(yè)化生產(chǎn)診斷和治療用生物產(chǎn)品的理想宿主，如各類重組蛋白質(zhì)和單克隆抗體等。另外，目前方興未艾的組織工程、干細胞工程等也是和細胞培養(yǎng)技術(shù)密切相關(guān)的，因此，可以說細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞工程、組織工程等研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)。本實驗的目的是讓學生學習和了解動物細胞培養(yǎng)的基本操作，以及相關(guān)的細胞培養(yǎng)前準備工作、細胞培養(yǎng)的環(huán)境條件和其他有關(guān)注意事項；用血球計數(shù)板

12、對培養(yǎng)瓶中的細胞進行計數(shù)以及用臺盼藍計細胞的存活率。二、 基本原理動物細胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出細胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體的細胞或組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)，是動物細胞工程的基礎(chǔ)。體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，原代培養(yǎng)是指將機體取出的細胞或組織進行實效培養(yǎng)的過程，這樣的細胞稱為原代細胞，原代細胞通常只能培養(yǎng)1050代左右即退化死亡；由原代細胞通過變異、分化等手段篩選出來具有無限次代培養(yǎng)能力的細胞群稱為細胞系，這類細胞的培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的細胞根據(jù)其生長方式，主要可分為貼附型細胞和非貼附型細胞兩類，貼附型細胞必須貼附在某一

13、固相表面才能生存和生長，非貼附型細胞可在培養(yǎng)液中懸浮生長，因而也叫懸浮型細胞。動物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)有很大不同，這主要是因為動物細胞無細胞壁，且大多數(shù)哺乳動物細胞只有附著在固體或半固體表面才能生長。雖然動物細胞培養(yǎng)的基本原理和微生物類似，但動物細胞對于營養(yǎng)的要求更加苛刻，除氨基酸、維生素鹽類、葡萄糖外，通常還需要血清；對于培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性也比微生物差，其對環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，培養(yǎng)過程中一般需嚴格監(jiān)控；動物細胞生長緩慢，因此培養(yǎng)時間較長，它們對環(huán)境的影響又比微生物大，因此常用空氣、氧氣、二氧化碳和氮氣的混合氣體進行供氧和調(diào)節(jié)pH。動物細胞培養(yǎng)還

14、需要防治污染問題，細菌、真菌、病毒或細胞均可導致動物細胞培養(yǎng)的污染，而生物的組織材料、操作者自身、培養(yǎng)基、各種器皿以及環(huán)境都有可能含有污染物。因為動物細胞的培養(yǎng)周期通常為數(shù)天到數(shù)周，培養(yǎng)時間較長，因此防治污染問題則更加顯得重要。細胞培養(yǎng)過程中需要對細胞生長狀態(tài)進行監(jiān)測，這就必須在培養(yǎng)過程中隨時取樣進行細胞計數(shù)。最簡單、直接和最經(jīng)濟的方法是用血球計數(shù)板計數(shù)。計數(shù)時取血球計數(shù)板四角的四個大方格，每個方格面積為1.0mm2，點樣后其厚度為0.1mm，這樣每個方格的體積即為1.010-4ml，細胞數(shù)的計算公式為：四個大方格總細胞數(shù)稀釋倍數(shù)1044，單位是細胞數(shù)/mL。細胞存活率或稱細胞活性的檢測是用臺

15、盼藍染色方法，其原理是活細胞的細胞膜完整，染色劑不能滲入，因而不能被染色，而死細胞的細胞膜不完整，細胞被染上藍色，存活率為：活細胞數(shù)總細胞數(shù)100。三、 儀器、材料和試劑1. 超凈工作臺2. 倒置顯微鏡3. 二氧化碳培養(yǎng)箱：設(shè)定二氧化碳濃度為5。4. 培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基，除菌過濾；自制無血清培養(yǎng)基，0.22m濾膜除菌過濾。5. 血清：Hyclone新生小牛血清。6. PBS緩沖液，0.22m濾膜除菌過濾。7. 胰酶：溶于PBS緩沖液，濃度0.25，0.22m濾膜除菌過濾。8. 玻璃方瓶、5ml和10ml移液管，121濕熱滅菌，30分鐘。9. 血球計數(shù)板10. 移液槍11. 臺盼藍染色液：0

16、.4克臺盼藍溶于100ml PBS緩沖液，過濾待用。四、 實驗步驟1. 貼附型細胞傳代培養(yǎng)（1） 倒掉將要傳代的細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；（2） 用10ml無菌PBS洗滌，倒掉；（3） 加入2ml胰酶溶液（0.25），進行消化；（4） 顯微鏡下觀察，直至所有細胞由鋪展狀態(tài)收縮為圓球形；（5） 倒掉胰酶；（6） 按稀釋要求加入新鮮培養(yǎng)基，吹打分散，分裝入玻璃方瓶，置于二氧化碳培養(yǎng)箱。2. 懸浮細胞傳代培養(yǎng)按貼附型細胞傳代培養(yǎng)步驟（6）操作即可。3. 細胞計數(shù)（1） 將干凈的蓋玻片覆蓋在血球計數(shù)板正中央，壓緊使它們之間不留空隙；（2） 待計數(shù)樣品如果需要，用PBS進行稀釋；（3） 取0.5ml稀釋后的

17、樣品，加入0.5ml臺盼藍染色液（0.4），用滴管輕輕吹打混合；（4） 用滴管將細胞懸浮液沿蓋玻片兩側(cè)緩緩滴入血球計數(shù)板的兩個平臺上，直至平臺上完全充滿細胞懸浮液， （5） 顯微鏡下計數(shù)，并按上述公式計算細胞密度；五、 注意事項1. 胰酶消化的程度必須掌握好，消化不足則細胞結(jié)團，無法分散，這將嚴重影響傳代后細胞的生長，消化過量則會使細胞嚴重受損；2. 在將細胞懸浮液滴加到血球計數(shù)板上時注意不能過量以至于細胞懸浮液溢出平臺，同時不能出現(xiàn)氣泡；3. 對于稀釋比例，應(yīng)掌握在每個大方格內(nèi)含2550個細胞為合適；4. 對于每個大方格中剛好壓在邊線上的細胞，應(yīng)當只計入兩條邊線上的細胞而忽略另兩條邊線上的細

18、胞，例如將上側(cè)和左側(cè)邊線上的細胞計入，那么下邊和右邊邊線上的細胞則不能計入，不論細胞是大半在方格內(nèi)還是小半在方格內(nèi)。六、 實驗記錄記錄四個大方格內(nèi)各自的活細胞數(shù)和死細胞數(shù)，并最終計算樣品的細胞密度。七、 思考題1. 傳代培養(yǎng)過程中導致污染的原因有哪些？2. 引起細胞計數(shù)誤差的原因有哪些？II.細胞的冷凍和復蘇一、 實驗?zāi)康募毎隗w外長期傳代中并不是穩(wěn)定不變的，它們常常會發(fā)生各種變異，表現(xiàn)在形態(tài)、生長特性、細胞的結(jié)構(gòu)甚至細胞核型也會發(fā)生變異，這些變異往往會導致目標產(chǎn)物的丟失，細胞功能的喪失以及生物安全性方面的問題。因此，在構(gòu)建好細胞株后需要建立一個細胞庫，用低溫冷凍的方法將細胞保存起來，以便隨時

19、有新鮮的細胞可供使用，確保研究或生產(chǎn)所用的細胞在一定的時間內(nèi)具有結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性和一致性。本實驗的目的是讓學生學習和了解細胞凍存、復蘇的目的和基本操作方法。二、 基本原理在動物細胞的組成成分中90以上是水，而水在冷凍過程中會形成冰晶，由于動物細胞沒有細胞壁，冰晶會使細胞膜發(fā)生破裂而導致細胞死亡，因此要維持冷凍和復蘇過程中細胞的存活率，必須在冷凍液中加入冷凍保護劑。常用的冷凍保護劑有二甲基亞砜（DMSO）和甘油，其中二甲基亞砜因為其對細胞具有良好的保護性和較低的毒副作用二成為首選。在冷凍和復蘇過程中影響細胞存活率的因素主要是保護劑濃度和溫度下降速率，實際操作中二甲基亞砜的濃度通常為510，一般來說，冷凍過程中溫度必須緩慢下降，盡可能減少細胞內(nèi)冰晶的形成；在復蘇過程中對細胞產(chǎn)生傷害的原因主要是解凍過程所形成的局