皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中Ptch1及Gli1表達(dá)的檢測(cè)

1、皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中Ptch?1及Gli?1表達(dá)的檢測(cè)    【摘要】  目的：探討Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路中Ptch?1和Gli?1在鱗狀細(xì)胞癌皮損和細(xì)胞系中的表達(dá)及意義. 方法：采用免疫組化技術(shù)分別檢測(cè)鱗狀細(xì)胞癌皮損和細(xì)胞系A(chǔ)431,HSQ?89,HSC?2和Tca中Ptch?1和Gli?1的蛋白水平表達(dá)與分布. 結(jié)果：Ptch?1及Gli?1在正常皮膚，鱗狀細(xì)胞癌皮損，細(xì)胞系A(chǔ)431，HSQ?89以及HSC?2細(xì)胞中均有陽(yáng)性表達(dá)，主要分布在鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)中. 結(jié)論：鱗狀細(xì)胞癌皮損和細(xì)胞系中Ptch?1及Gli?1的陽(yáng)

2、性表達(dá)可能通過(guò)激活Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路有助于鱗狀細(xì)胞癌的形成和發(fā)展. 【關(guān)鍵詞】  Hedgehog基因；信號(hào)傳導(dǎo)通路；免疫組化；癌,鱗狀細(xì)胞【Abstract】 AIM: To investigate the expressions and significance of Ptch?1 and Gli?1 in the squamous cell carcinoma lesions and the cell lines. METHODS: Immunohistochemical techniques were employed to detect the distribut

3、ion and expressions of Ptch?1 and Gli?1 in squamous cell carcinoma lesions and A431, HSQ?89, HSC?2 and Tca squamous cell carcinoma cell lines. RESULTS: There were significant expressions of Ptch?1 and Gli?1 in the squamous cell carcinoma lesions, normal tissue and in A431, HSQ?89 and HSC?2 squamous

4、cell carcinoma cell lines,and they were mainly distributed in the cell membrane and cytoplasma. CONCLUSION: Expressions of Ptch?1 and Gli?1 might contribute to formation and progression of squamous cell carci?noma via activating Hedgehog signaling pathway.【Keywords】 Hedgehog; signal transduction pat

5、hway; immunohistochemistry; carcinoma, squamous cell0  引言    皮膚鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）是皮膚科臨床上常見(jiàn)的表皮腫瘤之一,近年來(lái)其發(fā)病率明顯上升.雖然SCC的發(fā)生與基因突變及烴類(lèi)化學(xué)物質(zhì)的接觸等因素相關(guān)1,但迄今為止,SCC的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明.既往研究顯示,Hedgehog（Hh）信號(hào)傳導(dǎo)通路在SCC發(fā)病中有可能起著重要作用2.為進(jìn)一步探討Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路與SCC之間的關(guān)系,我們運(yùn)用免疫組化方法，觀察SCC皮損和多種SCC細(xì)胞系Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

6、的靶基因Gli?1和 Patched?1(Ptch?1)的表達(dá)情況.1  材料和方法.1  材料  2004/2006經(jīng)西京醫(yī)院皮膚科臨床和病理確診為皮膚SCC存檔蠟塊30（男19，女11）例,年齡5176(平均66.2±4.6）歲. 選取15例正常皮膚組織作為正常對(duì)照組. Tca人SCC細(xì)胞株（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍皮膚病研究所實(shí)驗(yàn)室保存）；A431人SCC細(xì)胞株（中國(guó)上海中科院細(xì)胞庫(kù)）；HSQ?89，HSC?2人SCC細(xì)胞株（日本Reken Cell Bank）；DMEM(Gibco公司)；胎牛血清（杭州四季青公司）；二甲基亞砜（西安化學(xué)試劑廠）；

7、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Ptch?1和Gli?1抗體 (美國(guó)Santa Cruz公司)，兩種抗體的工作濃度均為1200.免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒（北京中杉公司）.1.2  方法  免疫組化采用ABC法,石蠟切片脫蠟,梯度乙醇至水,PBS洗3次，30 mL/L H2O2?甲醇室溫浸泡510 min，枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行抗原微波加熱修復(fù)60 min,冷卻至室溫后用150的正常馬血清室溫孵育20 min, 加20 mL/L BSA稀釋至1200的一抗Gli?1和Ptch?1置于濕盒內(nèi)，4冰箱孵育過(guò)夜（12 h）.分別加20 mL/L BSA稀釋

8、至1200生物素標(biāo)記的抗山羊和抗兔二抗, 37孵育30 min, DAB顯色,顯微鏡下觀察,適時(shí)終止反應(yīng),蘇木精復(fù)染1530 s，脫水、透明、封片后，光鏡下觀察，每組實(shí)驗(yàn)均以已知陽(yáng)性切片（基底細(xì)胞癌）作陽(yáng)性對(duì)照,分別以PBS溶液代替一抗做陰性對(duì)照.    將Tca，A431，HSQ?89和HSC?2細(xì)胞以5×104/孔接種在鋪有載玻片的培養(yǎng)皿中,37在CO2孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜，分別用含0.5 mL/L新生小牛血清的DMEM (Tca)，高糖DMEM(A431，HSQ?89，HSC?2)同步化2 d,用冷丙酮固定細(xì)胞15 min,PBS洗滌5 min×

9、;3次，空氣中自然晾干；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；30 mL/L H2O2?甲醇室溫孵育510 min,以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性;PBS沖洗2 min共3次；50100 mL/L正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min. 傾去血清，勿洗，加20 mL/L BSA稀釋至1200的一抗Gli?1和Ptch?1置于濕盒內(nèi)，4過(guò)夜；PBS沖洗2 min共3次；滴加150稀釋的生物素標(biāo)記的二抗，37孵育30 min；PBS沖洗2 min共3次. 顯色劑顯色（DAB）,自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染、脫水、透明、封片. 用PBS代替一抗做陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性片做陽(yáng)性對(duì)照. 免疫組化結(jié)果SCC細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜

10、著棕黃色為陽(yáng)性. 隨機(jī)選取4個(gè)非連續(xù)的高倍鏡視野計(jì)數(shù)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)來(lái)計(jì)算評(píng)分1： 染色強(qiáng)度：0為陰性，1為弱陽(yáng)性，2為陽(yáng)性，3為強(qiáng)陽(yáng)性； 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：0為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10，2為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1050，3為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50. 之和為最后得分，得36分者為免疫組化染色陽(yáng)性.    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 采用SPSS 13.3統(tǒng)計(jì)軟件處理進(jìn)行2驗(yàn)檢, P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2  結(jié)果2.1  Gli?1和Ptch?1在SCC組織中的表達(dá)  正常皮膚組織中Gli?1陰性14例，陽(yáng)性1例，4例基底細(xì)胞癌均陽(yáng)性

11、. 皮膚組織中Gli?1陽(yáng)性18例（60.0，18/30）,陰性12例,陽(yáng)性染色仍定位于胞質(zhì). 正常皮膚組織中Ptch?1陰性13例,陽(yáng)性2例,皮膚組織中Ptch?1陽(yáng)性19例（63.3，19/30）,陰性11例,陽(yáng)性染色定位于胞質(zhì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1:2=11.66,P<0.01;2：2=10.04, P<0.01,圖1).2.2  Gli?1和Ptch?1在SCC細(xì)胞株中的表達(dá)  Gli?1和Ptch?1在細(xì)胞株A431，HSQ?89和HSC?2細(xì)胞中均呈陽(yáng)性表達(dá),Gli?1蛋白在A431細(xì)胞株和HSQ?89細(xì)胞株中陽(yáng)性染色定位于胞漿,在HSC?2細(xì)胞株

12、中Gli?1陽(yáng)性染色定位于胞質(zhì),部分胞膜也有陽(yáng)性染色. 而在Tca細(xì)胞株中Gli?1蛋白未見(jiàn)表達(dá)（圖2）.Ptch?1蛋白在A431細(xì)胞株和HSQ?89細(xì)胞株中陽(yáng)性染色定位于胞質(zhì),而在HSC?2細(xì)胞株和Tca細(xì)胞株中均未見(jiàn)表達(dá)（圖3）.A: Gli?1; B: Ptch?1.圖1  Gli?1和Ptch?1在鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)  SP ×400（略）A: A431; B: HSQ?89; C: HSC?2; D: Tca.圖2  Gli?1在鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)  SP ×400（略）A: A431; B: HSQ?89; C:

13、 HSC?2; D: Tca.圖3  Ptch?1在鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)  SP ×400（略）3  討論    Hh信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的調(diào)控胚胎發(fā)育的信號(hào)通路,在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用, 參與了人類(lèi)一些腫瘤的發(fā)生與發(fā)展2，Hh 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子的突變可導(dǎo)致腫瘤的形成,如基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌等3-4.目前關(guān)于Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在基底細(xì)胞癌中的重要作用已經(jīng)得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的公認(rèn)5. Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由十?dāng)?shù)個(gè)分子組成,我們之所以選用Ptch?1和 Gli?1作為研究對(duì)象,是因?yàn)樵诩韧芯恐幸殉浞肿C實(shí)Ptch?1

14、和Gli?1是Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起關(guān)鍵作用的結(jié)點(diǎn)之一：Ptch?1不僅是Hh信號(hào)的受體,同時(shí)是Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的目的基因,是該信號(hào)傳導(dǎo)通路重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子,Ptch?1基因失活與許多先天性疾病及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)；而 Gli?1是Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的一個(gè)重要因子,起著承上啟下關(guān)鍵性的調(diào)控作用,Gli?1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及惡性維持中的作用不容忽視6.既往研究發(fā)現(xiàn),在皮膚SCC皮損中有Ptch?1和Gli?1的表達(dá),免疫組化及原位雜交結(jié)果均顯示陽(yáng)性顆粒主要分布于SCC細(xì)胞胞質(zhì)中,胞核無(wú)明顯著色7. 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在SCC細(xì)胞系A(chǔ)431和KA中發(fā)現(xiàn)有Patched mRNA的突變,細(xì)胞系HSQ?89

15、,Ho?1u?1和T3M?1 Clone?2中有Shh,Patch,Smo和Gli的表達(dá),但是在細(xì)胞系Tca,HSC?4,Sa3,SCCTF,SCCTF和SCCKN中未有陽(yáng)性表達(dá)8-9.我們用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了皮膚SCC皮損中Ptch?1和Gli?1的表達(dá)情況, 再次驗(yàn)證了SCC皮損中Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路處于激活狀態(tài).我們發(fā)現(xiàn),在SCC皮損中,Ptch?1和Gli?1陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng),陽(yáng)性表達(dá)部位主要是癌細(xì)胞胞質(zhì)中,在腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有部分陽(yáng)性著色.檢測(cè)Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種皮膚SCC細(xì)胞系中的表達(dá)結(jié)果顯示,4個(gè)皮膚SCC細(xì)胞系中有3個(gè)細(xì)胞系呈陽(yáng)性表達(dá),Gli?1蛋白在A431細(xì)胞系和

16、HSQ?89細(xì)胞系中在胞漿表達(dá),在HSC?2細(xì)胞系中主要在胞質(zhì)表達(dá),部分胞膜也有表達(dá),而在Tca細(xì)胞系中Gli?1蛋白未見(jiàn)表達(dá).Ptch?1蛋白在A431細(xì)胞系和HSQ?89細(xì)胞系中主要在胞質(zhì)表達(dá),而在HSC?2細(xì)胞系和Tca細(xì)胞系中均未見(jiàn)表達(dá). 這些結(jié)果均提示在皮膚SCC皮損和細(xì)胞系中Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路處于激活狀態(tài),為進(jìn)一步深入研究Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在SCC發(fā)病及治療中的作用提供了依據(jù).【參考文獻(xiàn)】  1 Potti A, Moazzam N, Langness E, et al. Immunohistochemical determination of HER?2/neu, c?ki

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