精品資料（2021-2022年收藏）利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選油菜ATP6的相互作用因子圖文精

1、收稿日期 :2006209214基金項(xiàng)目 :國(guó)家自然科學(xué)基金 (30570986作者簡(jiǎn)介 :岳渝飛 (1985- , 男 , 四川大學(xué)生命學(xué)院 2003級(jí)本科生 . 通訊作者 :楊毅 . E 2mail :yangyi528vip.sina. com文章編號(hào) : 049026756(2007 0420922205利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選油菜A TP6的相互作用因子岳渝飛 , 劉志斌 , 王健美 , 向俊蓓 , (, 摘 要 :(B . , 線粒體 A TP 合成酶的一個(gè)亞基 A TP6與 . A TP6作為誘餌蛋白 , 應(yīng)用酵母雙雜交共轉(zhuǎn)化的方法篩選與 A TP6相互作用的蛋白質(zhì) . 在獲得的陽

2、性克隆中 , 發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與擬南芥中未知基因 A T 3G 47550所編 碼的蛋白質(zhì)具有較高同源性的蛋白質(zhì) . 它含有 RIN G HC 的結(jié)構(gòu) , 可能在泛素 2蛋白質(zhì)降解途徑 與細(xì)胞質(zhì)雄性不育間建立起了某種聯(lián)系 .關(guān)鍵詞 :酵母雙雜交 ; 細(xì)胞質(zhì)雄性不育 ;A TP6;RIN G 指結(jié)構(gòu) ; 泛素 2蛋白降解途徑 中圖分類號(hào) :Q81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :AIdentif ication of the interacting partners of ATP 6in Brassica napusby using the yeast t wo 2hybrid systemY U E Y u 2f e

3、i , L IU Zhi 2bi n , W A N G Jian 2mei , X IA N G J un 2bei ,W A N G Y an , L I X u 2f eng , YA N G Yi(K ey Labratory of Bio 2Resources and Eco 2environment of Ministry of Education ,College of Life Science ,Sichuan University ,Chengdu 610064,China Abstract :The cytoplasmic male sterile (CMS line of

4、 B rassica napus pol . is of great research utility among the rapeseed sterile lines. Researches of its molecular mechanism has substantiated that A TP6,subunit of the A TP synthase ,is related with CMS. By using of yeast two hybrid system ,A TP6was chosen as bait protein to screen its interacting p

5、artners. A fragment ,which has high identity with an unknown gene from A rabi dopsisthaliana (A T 3G 47550 ,was therefore found. The gene fragment has the structure of RIN G HC ,which sug 2gests its possible function between ubiquitin 2proteasome pathway and CMS. This paper would further the dis 2cu

6、ssion.K ey w ords :yeast two hybrid (Y2H ,cytoplasmic male sterility (CMS , A T P 6,RIN G finger ,ubiquitin 2pro 2teasome pathway1 引 言植物花粉敗育的現(xiàn)象稱為雄性不育 . 根據(jù)遺傳特點(diǎn)可分為核基因控制的核不育和細(xì)胞質(zhì)遺傳因素控制的細(xì)胞質(zhì)不育 (Cytoplasmic Male Sterity , CMS . CMS 植株長(zhǎng)有缺陷的雄花 , 但雌花器官正2007年 8月 第 44卷第 4期 四川大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 Journal of Sichuan Unive

7、rsity (Natural Science Edition Aug. 2007Vol. 44 No. 4常 , 營(yíng)養(yǎng)體部分也沒有缺陷 , 它不能產(chǎn)生可育花粉 , 并且與正?；ㄏ啾绕浣Y(jié)構(gòu)發(fā)生了重大改變 . 油菜 CMS 類型根據(jù)細(xì)胞質(zhì)來源可分為兩類 , 一類是植 物自然繁殖過程中因突變或品種間雜交產(chǎn)生的 ; 另 一類是通過種屬間遠(yuǎn)緣雜交或原生質(zhì)體融合而又 核置換引起的 . 波利馬 (Polima 胞質(zhì)不育系 (Pol. 屬于前一種類型 . 根據(jù)目前分子水平的研究 , 越來 越 多 的 證 據(jù) 表 明 , 線 粒 體 DNA (mitochondrial DNA , mtDNA 及 其 表 達(dá)

8、產(chǎn) 物 與 直 關(guān) 1. 早期關(guān)于質(zhì)基因 (, 這 就表明線粒體基因是與 CMS 相關(guān)的 2. 線粒體 DNA 對(duì)于 CMS 的影響 :一是致使植株呼吸效率降 低 ; 二是會(huì)導(dǎo)致花型的改變和花粉結(jié)構(gòu)的缺陷 . 其 中前者是主要影響 . 有一種假定認(rèn)為是 CMS 基因 致使線粒體功能受到削弱從而無法滿足花及花粉 形成過程中某些途徑較高的能量需求和特殊的代 謝需求 , 其他組織并沒受到影響是因?yàn)樗鼈儾⒉恍?要如此高的線粒體活性 , 或者是因?yàn)?CMS 基因僅 僅在雄花器官的發(fā)育過程中高效的表達(dá) 3. A T P 6是線粒體 A TP 合成酶的一個(gè)亞基 , 其對(duì)能量代謝 的影響可能是導(dǎo)致花粉敗育的一

9、個(gè)重要原因 . Homme 和 Brown 認(rèn)為 , A T P 6基因是 CMS 敏感部 位 4. 線粒體 A T P 6轉(zhuǎn)錄本的編輯在一種 CMS 高 粱的雄性器官中 (非幼苗中 大大降低 5. A T P 6基 因的 編 輯 發(fā) 生 改 變 與 水 稻 中 的 CMS 相 關(guān) 6. A T P 6的 RNA 編輯發(fā)生改變與編碼區(qū)域發(fā)生點(diǎn)突 變的結(jié)果類似 , 都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的人類疾病 . 在油菜 Pol. 中與 CMS 相關(guān)的 mtDNA 位點(diǎn)為 O R F 224/ A T P 67. 對(duì)甘藍(lán)型油菜體細(xì)胞雜種的分析表明 , Pol. CMS 胞質(zhì)不育的雜種后代都含有 O R F 224/

10、A T P 6基因座位 , 這一基因座位與 Pol. CMS 性狀 是高度連鎖的 8. 在 Pol. CMS 系中 , O R F 224與 A T P 6兩者 “共轉(zhuǎn)錄 (cotranscribe ” 產(chǎn)生 2. 2、 1. 9和 1. 1kb 的 3個(gè) mRNA 轉(zhuǎn)錄本 , 而正?？捎|(zhì) 只產(chǎn)生 1個(gè) A T P 6轉(zhuǎn)錄本 . 育性恢復(fù)基因可增加 1. 1kb mRNA 轉(zhuǎn)錄本的量 , 2和 1. 9kb 1. 4和 3.A T P 6作為 , cDNA 文庫 , 發(fā)現(xiàn)與 A T P 6相互作用的蛋白質(zhì) , 進(jìn)而深入 探索 A T P 6及其相關(guān)基因的功能 , 以期為 CMS 找 到注解

11、 .2 實(shí)驗(yàn)材料與方法2. 1 實(shí)驗(yàn)材料AH109酵母菌株 、 p G B KT7253、 p G AD T72REC 載體 、 p G B KT7載體 、 甘藍(lán)型油菜 “波里馬” 細(xì)胞質(zhì) 雄性不育系的恢復(fù)系 84100218幼葉和鮭魚精擔(dān)體 DNA , 酵 母 培 養(yǎng) 用 的 YPD Medium 、 SD Minimal medium 、 2Trp DO Supplement 、 2Leu DO Supple 2 ment 、 2Leu/2Trp DO Supplement 、 2Leu/2Trp/2His DO Supplement 、 2Ade/2His/2Leu/Trp DO Sup

12、ple 2 ment 均購(gòu)自 CLON TECH. 硫酸腺嘌呤 (Adenine hemisulfate 購(gòu)自 G ibco ; PEG 3250和 I yticase 購(gòu)自 Sigma ;DMSO 購(gòu)自 AMRESCO ; DH5大腸埃希菌 菌株 、 X 2G al 、 PCR 用的試劑及 T4DNA 連接酶購(gòu)自 Takara 公司 . 其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑購(gòu)自成都 博瑞克生物技術(shù)公司 .2. 2 方 法2. 2. 1 目的基因擴(kuò)增及誘餌載體的構(gòu)建 根據(jù) NCB I 上已發(fā)表的甘藍(lán)型油菜 A T P 6序列設(shè)計(jì)一 對(duì)引物 Sense :52CTA TG AA TCAAA TA GGGCTG

13、GT 23 B am H Antisense :52AA AA TGG A G A TTTA TA GCA TCA TTC 23 Pst 利用 CTAB 法提取油菜總 DNA , 使用上述引 物和模板擴(kuò)增基因 A T P 6. PCR 反應(yīng)條件是 94 2min ;94 30,57 30,72 1min , 共 35個(gè)循 環(huán) ;72 延伸 10min ,8 10min.膠回收 PCR 產(chǎn)物 . 用 B am H 和 Pst 酶切 擴(kuò)增到的 A T P 6和克隆載體 p G B KT7, 利用膠回 收試劑盒回收大 、 小片斷 . T4DNA 連接酶連接大 小片斷 , 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5.2.

14、 2. 2 ds cDNA 文庫構(gòu)建 取甘藍(lán)型油菜 “波里 馬” 細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系 84100218幼葉按 照張年輝等的方法提取總 RNA 10, 其濃度為 4. 9 329第 4期 岳渝飛等 :利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選油菜 A T P 6的相互作用因子 ×10-6g/L , OD 260:OD280=2. 125. 雙鏈 cDNA 合 成完全按照 CLON TECH 的 “ BD Mactmaker TM Li 2 brary Construction &Screening K its ” 用戶手冊(cè)進(jìn) 行 , 之后使用 BD CHROMA SPIN 純化產(chǎn)物 . 2.

15、 2. 3 酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化及陽性克隆篩選 下述步驟 完全按照 CLON TECH 提供的方法 . 從 DH5中抽 提質(zhì)粒 p G B KT72A TP6, 利用 PEG /LiAc 法轉(zhuǎn)化酵 母細(xì)胞 AH109細(xì)胞 , SD/2Trp 缺陷培養(yǎng)基 30 培 養(yǎng) 4d. 挑單克隆于液氮中冷凍后 Z中孵育 8h , p G 2和 G B KT72Lam 載體的 YH109菌 株 作 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 , 將 ds cDNA 和 p G AD T 2Rec 共 轉(zhuǎn) 化 已 含 有 p G B T72A TP6的 AH109感受態(tài)細(xì)胞 . 同時(shí)設(shè)立正對(duì)照 :SV40Large T PCR Fragme

16、nt 和 p G AD T72Recp G B KT7253共轉(zhuǎn) 化攜帶 p G B KT7253的菌株形成 AH109pG AD T72 Rec T +p G B KT7253; 負(fù)對(duì)照 :AH109p G AD T72 Rec T +p G B KT72Lam .轉(zhuǎn)化了的酵母細(xì)胞在選擇 性平板培養(yǎng)基 SD/2Leu/2Trp/2His 上培養(yǎng) 410 d , 能生長(zhǎng)起來的即是一些候選 His3陽性克隆 . 再 將這些候選陽性克隆在 SD/ Ade/2Leu/2Trp/2His 平板上 30 培養(yǎng) 38d , 之后用濾紙印跡法來檢 測(cè)菌落中 L acZ 報(bào)告基因的表達(dá) (2半乳糖苷酶活 性

17、, 以剔除部分假陽性克隆 . 然后提取陽性克隆質(zhì) 粒 , 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5, 在含 Amp 的 LB 平板培 養(yǎng) , 能生長(zhǎng)的即含陽性 AD 克隆質(zhì)粒 . 提取質(zhì)粒 . 質(zhì) 粒 PCR 檢測(cè)以合并重復(fù)片斷 , 分別使用 Taq 和 Bsu R1酶切剔除相同片斷 . 挑菌 , 液體 LB +Amp 擴(kuò)大培養(yǎng) , 送公司測(cè)序 .2. 3 生物信息學(xué)初步分析將測(cè)序結(jié)果在 NCB I 上進(jìn)行蛋白和氨基酸比 對(duì) , 尋找同源序列 , 預(yù)測(cè)基因功能 , 為克隆基因全長(zhǎng) 及其深入研究打下基礎(chǔ) .3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. 1 構(gòu)建 A TP62BD 誘餌酵母菌株利用 PCR 法擴(kuò)增得到的油菜 Pol. A T P

18、 6基因 (圖 1 , 除去兩端酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基 , 共 786個(gè) 堿基 , 同 NCB I 上注冊(cè)的序列完全一致 . 成功構(gòu)建 了 p G B KT72A TP6載體 (圖 2 , 并轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞 AH109, 在選擇性平板培養(yǎng)基 SD/2Trp 篩選獲得攜 帶 p G B KT72A TP6誘餌載體的 AH109, 菌落表面 有光澤 , 呈丘狀隆起 , 表明 A TP6對(duì)酵母無毒性 ; AH109(p G B KT72A TP6 單克隆經(jīng)液氮處理后 , 在 Z 緩 沖 液 /X 2gal 中 孵 育 8h 顏 色 不 變 藍(lán) , 說 明 A TP6蛋白無自發(fā)激活 L acZ 報(bào)告基因的能

19、力 .圖 1 PCR 擴(kuò)增得到的含兩端分別含 B am H 、 Pst 酶 切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的 A T P 6基團(tuán)Fig. 1 The complete A T P 6coded sequence with B am H 、 Pst restriction sites and protection bases on the temini圖 2 使用 B am H 和 Pst 雙酶切 p G B KT72A TP6載 體得到的電泳圖Fig. 2 Agarose electrophoresis analysis of vector p G B KT72 A T P 6digested by B a

20、m H and Pst after A T P 6fragmenthas been subcloned into p G B KT7 vector3. 2 利用共轉(zhuǎn)化篩選了甘藍(lán)型油菜 cDNA 經(jīng)共轉(zhuǎn)化得到的酵母陽性克隆共 1087個(gè) (圖 3為多個(gè)長(zhǎng)出菌落的 SD/2Ade/2His/2Leu/2Trp 平 板中的一個(gè) , 使用濾紙印跡法菌落檢測(cè) L acZ 報(bào) 告基因的表達(dá) ,8h 內(nèi)變藍(lán)的有 797個(gè) , 其中包括正 對(duì)照 ; 負(fù)對(duì)照 8h 內(nèi)不變藍(lán) . 圖 4為其中一張濾紙 X 2gal 顯色檢測(cè)的結(jié)果 .429四川大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 第 44卷 圖 3 在 SD/2Ade/2Hi

21、s/2Leu/2隆Fig. 3con SD/2Ade/His/2圖 4 L ocZ 報(bào)告基因表達(dá)分析Fig. 4 Expression analysis of L acZ reportergene filter assay圖左上方正對(duì)照顯示為藍(lán)色 , 負(fù)對(duì)照不顯色 , 其余顯色為藍(lán)色的是篩選到的陽性克隆3. 3 陽性克隆插入片斷 PCR 檢測(cè)按照 p G AD T72REC 插入片斷兩端的 SMAR T 位 點(diǎn) 和 CDS 位 點(diǎn) 分 別 設(shè) 計(jì) 上 游 引 物 (52CT ATTCG ATG ATG AAG AT ACCCCACCAAACCC 23 和下游引物 (52GTG AACTTG C

22、G GGGTTTTTCAG 2T ATCT AG AT 23 , 按照程序 :94 2min ;94 30s ,64 30s ,72 2min , 共 35個(gè)循環(huán) ;72 延伸 10min ,8 10min. 并以陽性克隆 p G AD T72REC質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR (圖 4為檢測(cè)結(jié)果的一個(gè)部分 , 以合并重復(fù)片斷 , 分別使用 Taq 和 Bsu R 酶切剔除相同片斷 . 最后總共得到 122個(gè)大于 500bp 的不同大小的基因片斷 , 圖 5為其中的一部分 .5p G ADT72Rec 陽性克隆 PCR 質(zhì)粒檢測(cè)的部分結(jié)果Fig. 5 Agarose electrophoresis

23、analysis of positivep G ADT72Rec clonesThe second band from lower to upper of Marker stands for 500bp3. 4 測(cè)序結(jié)果及序列分析將篩選到的基因片斷放到 NCB I 上進(jìn)行核酸 和氨基酸比對(duì) , 發(fā)現(xiàn)油菜中一個(gè)含有 RIN G 指結(jié)構(gòu) 的蛋白與 A T P 6有相互作用 , 其編碼區(qū)同擬南芥 未命名基因 A T 3G 47550有較高的同源性 .4 結(jié) 語鋅指蛋白是基于它的結(jié)構(gòu)特征而得名 , 在鋅指 蛋白中 , 幾個(gè)保守的氨基酸 (通常為 Cys 與 His 與 一個(gè) Zn 結(jié)合 , 形成一個(gè)稱

24、為鋅指的相對(duì)獨(dú)立的功 能區(qū)域 . 鋅指蛋白往往具有不止一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu) , 它 廣泛分布在動(dòng)植物和微生物中 , 從酵母到人體 , 常 作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與在基因的表達(dá)調(diào)控 、 細(xì)胞分化 、 胚胎發(fā)育等許多生命過程 .而最近幾年關(guān)于 RIN G 指的研究成為該領(lǐng)域 的一個(gè)熱點(diǎn) .本次實(shí)驗(yàn)篩選得到的序列中 , 得到了一個(gè) 651bp 的含有 C 3HC 4結(jié)構(gòu)的 RIN G 指 (RIN G HC 蛋 白編碼序列 , 下面是該序列與擬南芥未命名基因編 碼蛋白 A T3G 47550在 NCB I 上的氨基酸比對(duì)結(jié) 果 . RIN G 指是一個(gè)小的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域 , 不同于普通的鋅指結(jié)構(gòu) , 它能通

25、過獨(dú)特的 “交叉帶”(cross brace 結(jié)合兩個(gè)鋅原子 , 常見于復(fù)合蛋白質(zhì)絡(luò)合物 的亞基 . 具有 RIN G 指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)往往同時(shí)具有 與蛋白質(zhì)和 DNA 結(jié)合的能力 11. 而目前發(fā)現(xiàn)的具有 C3HC4結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)大多具有泛素 2蛋白質(zhì)連 接 酶 (ubiquitin 2protein ligases , E3s 活 性 . 含 有 RIN G 指結(jié)構(gòu)域的 E3s 可分為幾個(gè)亞類 :單亞基 RIN G E3s (single subunit RIN G E3s 、 后期促進(jìn)復(fù) 合物 (anaphase 2promoting complex ,APC 、 SCF 型529第 4期

26、岳渝飛等 :利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選油菜 A T P 6的相互作用因子 E3s 和 VCB 2CUL2復(fù)合物 (VBC . 其中后三個(gè)亞 類都已在植物中發(fā)現(xiàn) 12. 泛素蛋白降解系統(tǒng)可以 調(diào)控許多重要過程 , 如細(xì)胞循環(huán) 、 信號(hào)傳導(dǎo) 、 基因 轉(zhuǎn)錄 、 胞吞作用以及免疫反應(yīng) 、 雄性不育和細(xì)胞程 序化死亡等 13,14.目前 , 對(duì) SCF 型 E3s 的研究最為詳盡 . SCF E3s 包含 4個(gè)亞基 :負(fù)責(zé)與蛋白底物結(jié)合的 F 2box 蛋白 (FBP 、 SKP1(S 2phase kinase. associated pro 2 tein 1, 擬 南 芥 中 為 ASK1 、 RIN

27、 G 蛋ROC1/HR T1和,是必需的 16. , 戴良英等人利用酵母雙雜交證 實(shí)了 ASK1與 F 2box 蛋白 COI1發(fā)生相互作用并在 植物體內(nèi)形成蛋白復(fù)合體 , 然后利用反義 RNA 策 略進(jìn)行功能分析證明了 ASK1調(diào)控植物的雄性不 育 17. 成建紅等最近在一些配子體型自交不親和 植物 S 2RNase 基因近旁相繼發(fā)現(xiàn)了一類花粉特異 性表達(dá)的 F 2box 基因 , 從而預(yù)示泛素介導(dǎo)的 SCF 蛋 白 降 解 途 徑 可 能 參 與 配 子 體 自 交 不 親 和 反 應(yīng) 18.由于目前植物克隆的 RIN G 指蛋白還很少 , 還 無法對(duì)其功能得到較完整的闡釋 . 但結(jié)合 R

28、IN G 指 蛋白參與的泛素 -蛋白降解途徑在生物體內(nèi)廣泛 的作 用 , 特 別 是 該 途 徑 在 氧 化 壓 力 (可 能 涉 及 A TP6相關(guān)的呼吸途徑 以及細(xì)胞內(nèi)異常蛋白積聚 (CMS 導(dǎo)致胞內(nèi)異常蛋白增多 時(shí)所表現(xiàn)出的作 用 , 繼續(xù)就本次實(shí)驗(yàn)篩選出的這一基因片段做深入 研究 , 對(duì)于揭示油菜 Pol. CMS 會(huì)是項(xiàng)很有意義的 工作 .參考文獻(xiàn) :1 Budar F , Touzet P ,de Paepe R. The nucleo 2mitochon 2 drial conflict in cytoplasmic male sterilities revisited J. G

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