柑桔黃龍病診斷技術(shù)研究進(jìn)展

1、柑桔黃龍病診斷技術(shù)研究進(jìn)展廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)2008年第6期柑桔黃龍病診斷技術(shù)研究進(jìn)展王愛民.鄧曉玲(1.廣州市農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測中心,廣東廣州510315;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,廣東廣州510642)摘要:柑桔黃龍病是一種毀滅性病害,介紹了柑桔黃龍病的診斷發(fā)展過程,具體包括柑桔黃龍病的癥狀診斷法,指示植物診斷法,生化指標(biāo)鑒定法,電鏡觀察法,血清學(xué)診斷法,DNA探針雜交法以及PCR擴(kuò)增法等技術(shù).關(guān)鍵詞:柑桔;黃龍病;診斷技術(shù)中圖分類號(hào):$436.661.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004-874X(2008)06010103柑桔黃龍病(citrushuanglongbing.HLB)是柑桔生產(chǎn)的

2、毀滅性病害,最早在我國廣東省潮汕地區(qū)發(fā)現(xiàn).1995年前,該病在不同國家和地區(qū)有不同的名稱,在我國大陸稱為黃龍病或黃梢病(yellowshootdisease).在南非稱為青果病(greening),在印度稱為頂梢枯死病(dieback),在菲律賓稱為葉斑病(1eafmottle),在印度尼西亞稱為葉脈韌皮部惡化病(veinphloemdegeneration).而國際上一般稱之為柑桔青果病(citrusgreening).直到1995年,在第l3屑國際柑桔病毒學(xué)家會(huì)議(internationalorganizationofcitrusvirologists,IOCV)上,為紀(jì)念我國植物病理學(xué)家

3、林孔湘教授首次證實(shí)該病害是一種傳染性病害的原創(chuàng)性T作,決定以柑桔黃龍病作為該病害的正式學(xué)名,并確認(rèn)了我國科學(xué)家對(duì)這種世界性重要病害研究所作出的卓越貢獻(xiàn).迄今為止,柑桔黃龍病已在亞洲,非洲,美洲的40多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生流行21.柑桔黃龍病的癥狀非常復(fù)雜,在不同生長季節(jié)可以表現(xiàn)不同的癥狀類型31.大多數(shù)人認(rèn)為柑桔黃龍病由局限于韌皮部篩管細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性細(xì)菌所引起141,該病菌歸屬于原核生物,薄壁菌門,變形菌綱,僅一亞綱的韌皮部桿菌屬.目前柑桔黃龍病菌共發(fā)現(xiàn)3個(gè)種:亞洲種(CandidatusLiberibacterasiaticus.Las).主要分布在亞洲國家和美國佛羅里達(dá)州.在巴西圣保羅州,

4、毛里求斯,留尼旺島也發(fā)現(xiàn)小部分黃龍病菌屬于亞洲種;非洲種(CandidatusLiberibacterafrieanus,Laf),主要分布在非洲國家:美洲種(CandidatusLiberibacteramericus,Lam),主要分布在巴西圣保羅地區(qū)【3_51.柑桔黃龍病菌的遠(yuǎn)距離傳播主要依靠帶病苗木和接穗的調(diào)運(yùn),田間收稿日期:20o80319基金項(xiàng)目:廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(06025850);農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物病蟲害疫情監(jiān)測與防治項(xiàng)目(4200一C07041)作者簡介:王愛民(1965一),男,碩士,農(nóng)藝師通訊作者:鄧曉玲(1966一),女,碩十,副教授,Email:xldengsacu.

5、edu.ca101近距離傳播主要依靠柑桔木虱【.目前還沒有發(fā)現(xiàn)抗病品種和特效藥劑,因此,防治柑桔黃龍病必須采取綜合的防治措施才能取得良好的效果.我國很多研究者為防治柑桔黃龍病作出了很大努力并取得了卓有成效的成果8-9.目前.對(duì)柑桔黃龍病的診斷主要有癥狀診斷,指示植物鑒定,電鏡觀察,生化指標(biāo)鑒定,血清學(xué)診斷,DNA探針雜交以及PCR擴(kuò)增技術(shù)等方法,現(xiàn)對(duì)各種診斷方法簡介如下.供廣大柑桔種植者參考.1癥狀診斷長期以來對(duì)柑桔黃龍病主要是根據(jù)田間癥狀來進(jìn)行診斷:(1)柑桔植株剛開始發(fā)病時(shí),頂部有1枝或數(shù)枝新梢的葉片停止轉(zhuǎn)綠,表現(xiàn)為樹冠頂部枝梢黃化,即出現(xiàn)"黃梢"(2)出現(xiàn)特異的斑駁型

6、黃化癥狀,主要表現(xiàn)為由葉脈基部和側(cè)脈附近開始黃化,逐漸擴(kuò)大形成黃,綠相間的不對(duì)稱斑駁狀.斑塊形狀和大小不一;(3)桔類植株感染黃龍病在成熟期常表現(xiàn)為果蒂部深紅色,俗稱"紅鼻子果".柑桔黃龍病的癥狀有一定的特異性,具有診斷價(jià)值.目前,主要選擇每次新梢的成熟期.特別是在每年l0l2月秋梢成熟以后,根據(jù)當(dāng)年春梢葉片的斑駁癥狀來診斷田間的黃龍病病樹.但是.柑桔黃龍病癥狀發(fā)展過程會(huì)受到環(huán)境條件的影響,例如果園管理不良,缺乏營養(yǎng)或其他病蟲害混合危害時(shí)也有類似癥狀,而已經(jīng)感染黃龍病但尚未表現(xiàn)明顯癥狀的植株難以依據(jù)癥狀作出準(zhǔn)確的診斷.因此,癥狀診斷在必要時(shí)要與其他診斷方法相結(jié)厶【Ol.2指

7、示植物鑒定柑桔黃龍病的早期診斷是將可疑的枝條嫁接到容易感病的指示植物上,接種34個(gè)月后觀察其發(fā)病情況.不同地區(qū)使用的指示寄主不同,如南非用伏令夏(Valencia)tlIj,印度用Kagzi株檬(C.aurantifolia)作為黃龍病的指示植物【,而我國多用椏柑作為黃龍病的102指示植物_3】.雖然指示植物嫁接鑒定比田間診斷準(zhǔn)確,但周期太長,不利于快速檢測.3電鏡觀察自1970年Lafleche等I13】用電鏡觀察到黃龍病菌以來,電鏡觀察一直作為柑桔黃龍病重要的鑒定和診斷手段.在電鏡下.根據(jù)黃龍病菌的形態(tài),大小及菌體壁膜結(jié)構(gòu)等特征可以作出正確的診斷.但由于柑桔樹體內(nèi)的黃龍病菌濃度較低,且分布

8、不均勻,電鏡制樣材料較小以及需具備電鏡器材,使得電鏡診斷法在生產(chǎn)中很難推廣應(yīng)用4生化指標(biāo)鑒定20世紀(jì)80年代中期,我圍采用熒光顯微鏡檢測法對(duì)黃龍病進(jìn)行診斷.發(fā)現(xiàn)感病韌皮部呈現(xiàn)黃色熒光,而健康植株,病毒侵染或缺素癥狀組織中沒有黃色熒光.此法在發(fā)病初期檢測有效,但是特異性不強(qiáng).后來采用感病植株的生化指標(biāo)進(jìn)行診斷,其原理是利用感病植株韌皮部特有的熒光物質(zhì)龍膽葡糖苷作為指示物質(zhì),感病組織可在365nm波長下觀察到亮藍(lán)紫色斑點(diǎn)14I5血清學(xué)診斷由于黃龍病菌目前還不能進(jìn)行人工培養(yǎng),不能獲得病菌純培養(yǎng),因此要制備高效的黃龍病菌單克隆抗體比較困難.柯穗等(1986)研究報(bào)道利用菟絲子可以成功地將黃龍病病原體從

9、柑桔轉(zhuǎn)移到草本植物長春花上,病原體能夠更好地繁殖和生長;以長春花病株的葉脈為材料,采用酶解,差速離心和Percoll梯度離心方法,可以獲得完整菌體的粗提純物,這些粗提物可用于改進(jìn)的血清免疫方法20世紀(jì)80年代,法國建立了針對(duì)印度浦那和非洲黃龍病菌的單克隆抗體HLB血清學(xué)檢測方法.可以分別鑒別來自印度,菲律賓,留尼汪島等的黃龍病樣品,但不能鑒別來自中國的樣品.單克隆抗體兇專一性過強(qiáng),難以應(yīng)用于不同地域的黃龍病菌變異菌株,可能會(huì)發(fā)生漏檢,因此,單抗的應(yīng)用受到很大的限制6核酸探針檢測核酸分子雜交的原理是:在一定的條件下,具有一定同源性的2條核酸單鏈按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈;雜交雙方是待測核酸和標(biāo)記

10、探針,常選用的標(biāo)記物是放射性同位素或非放射性物質(zhì)如生物素等,雜交后通過標(biāo)記探針放射自顯影或尼龍膜顯影就可達(dá)到檢測的目的.該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是檢測快速專一,靈敏度高達(dá)納克級(jí).Villeehanoux等【16首次利用DNA探針檢測柑桔黃龍病,制備的探針只能檢測出亞洲種黃龍病而不能檢測出非洲種.Hocquellet等成功獲得2個(gè)用DIG標(biāo)記的非放射性探針ln一2.6和AS一1.7,可分別檢測亞洲種和非洲種黃龍病菌.在國內(nèi),也有研究采用DIG對(duì)克隆的黃龍病菌DNA片斷進(jìn)行標(biāo)記,制備非放射性探針檢測黃龍病菌.但分子探針雜交過程復(fù)雜,DNA用量大等兇素限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用18j.7PCR檢測技術(shù)隨著分子生物學(xué)

11、技術(shù)的迅速發(fā)展,細(xì)菌的檢測技術(shù)也進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代,許多新技術(shù)和新方法在細(xì)菌研究中得到廣泛應(yīng)用.Jagoueix等ll9J利用細(xì)菌的通用引物擴(kuò)增得到黃龍病菌的16SrDNA序列,據(jù)此序列設(shè)it-特異引物OI1/OI2c,并通過常規(guī)PCR對(duì)亞洲種和非洲種的柑桔黃龍病菌進(jìn)行擴(kuò)增,得到的特異性片斷長度均為1167bp;采用限制性內(nèi)切酶Xbal酶切PCR產(chǎn)物,非洲種的PCR產(chǎn)物被酶切為3條片斷(520,506,130bp),亞洲種的PCR產(chǎn)物被酶切為2條片斷(640,520bp),根據(jù)酶切產(chǎn)物的不同可以區(qū)分亞洲種和非洲種柑桔黃龍病菌.但011/012c不能擴(kuò)增美洲種柑桔黃龍病菌,要鑒定美洲種黃龍病菌

12、,國際細(xì)菌命名委員會(huì)規(guī)定采用特異引物GBI/GB31.Hocquellet等(1999)根據(jù)柑桔黃龍病菌B一操縱子核糖體蛋白基因(rp/KAJLrpoBC)設(shè)計(jì)特異引物A2/J5對(duì)亞洲種和非洲種的柑桔黃龍病菌進(jìn)行擴(kuò)增,亞洲種的PCR產(chǎn)物長度為703bp,非洲種的PCR產(chǎn)物長度為669bp,根據(jù)PCR產(chǎn)物長度的不同可區(qū)分亞洲種和非洲種柑桔黃龍病菌.由于PCR技術(shù)的應(yīng)用,使得黃龍病菌的檢測技術(shù)得到飛速發(fā)展,在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上衍生發(fā)展了靈敏度更高,特異性更強(qiáng)的巢式PCR技術(shù)(NestedpolymerasechainreactionNestedPCR).該方法是利用2套PCR引物進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增反

13、應(yīng),在第1輪擴(kuò)增中.外套引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物,擴(kuò)增所得產(chǎn)物在內(nèi)嵌引物的存在下進(jìn)行第2輪擴(kuò)增.由于巢式PCR反應(yīng)有2次PCR擴(kuò)增.因此,雖然增加了擴(kuò)增反應(yīng)的復(fù)雜性但降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性,增加r檢測的特異性.Harakava等201研究發(fā)現(xiàn)巢式PCR檢測的靈敏度比常規(guī)PCR有所提高.李韜等【2Ij應(yīng)用巢式PCR檢測柑桔木虱及九里香上的黃龍病帶菌率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR只可檢測到最低2頭帶菌術(shù)虱,巢式PCR可檢測到單頭帶菌木虱,說明巢式PCR比常規(guī)PCR靈敏.應(yīng)用巢式PCR能有效提高檢測的靈敏度,但也要注意避免假陽性的出現(xiàn).為了克服常規(guī)PCR和巢式PCR不能準(zhǔn)確定量,容易交叉污染和容易產(chǎn)生假陽

14、性等問題,逐漸發(fā)展了實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimetuorescentquantitativePCR)技術(shù).realtimePCR技術(shù)融合了PCR和DNA探針雜交技術(shù),在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán).利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR過程.最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析.該技術(shù)作為核酸定量的手段,以高靈敏性,高特異性,高精確度,實(shí)時(shí)性,少污染等優(yōu)點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍.在植物病原物檢測中得到廣泛的應(yīng)用.廖曉蘭等【22設(shè)計(jì)HLBprobe作為特異性探針,在國內(nèi)首次建立了柑桔黃龍病病原實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系.其檢測靈敏度比常規(guī)PCR高100倍.胡浩等1231用TaqM

15、an探針法和SYBRGreenI熒光染料法建立了2種實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法穩(wěn)定性好,污染少,操作簡便,是準(zhǔn)確,靈敏,快速甄別柑桔黃龍病病原菌近緣種的檢驗(yàn)檢疫技術(shù).Li等I24對(duì)亞洲種,非洲種,美洲種柑桔黃龍病菌分別設(shè)計(jì)特異引物和特異探針,利用常規(guī)PCR和realtimePCRTaqMan探針法對(duì)柑桔黃龍病病原菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)0.02mg的葉片中脈都能檢測到黃龍病病原.對(duì)比發(fā)現(xiàn)realtimePCR比常規(guī)PCR靈敏度更高,特異性更強(qiáng),重復(fù)性更好,是柑桔黃龍病早期病害診斷的有效手段參考文獻(xiàn):1】ReinkingOA.Diseasesofeconomicplants

16、inSouthChinaJ.PhilippineAgricahure,1919(8):109-135.22GottwaldTR,daGracaJV,BassaneziRB.CitrusHuanglongbing:thepathogenanditsimpactJ/OL.PlantHealthProgress,2007,doi:10.1094/PHP一20070906一OlRV.3】林孔湘.柑桔黃梢(黃龍)病研究J.植物病理,1956,2(1):142.4】BoveJM.Huanglongbing:adestructive,newly-emerging,century-olddiseaseofci

17、trus叨.JournalPlantPathology,2006,88(1):737.5】TeixeiraDC'DanetJLEveillards,etaLCitrushuanglongbinginSanPauloState,BraziPCRdetectionofthe"CandidatusLiberibacter"speciesassociatedwiththediseaseJ.MolecularandCellularProbes,2005,19:.173179.6】廣東農(nóng)林學(xué)院植病教研組.柑桔術(shù)虱傳遞柑桔黃龍病試驗(yàn)初報(bào)J1.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),1977(6):5053

18、.7】HalbertSE,ManjunathKL.Asiancitruspsyllids(Stemorrhyncha:Psyllidae)andgreeningdiseaseincitrus:AliteraturereviewandassessmentofriskinFloridaJ.FloridaEntomol,2004,87:330354.【8】林孔湘,駱學(xué)海.柑桔黃梢(龍)病熱治療的初步研究J.植物保護(hù),1965,4(2):169174.9】柯沖.柑桔黃龍病病原研究與防治建議J.中國柑桔,1979,34(3):2932.10】林孔湘.柑桔黃龍病問題的討論【J】.柑桔科技通訊,1977(3

19、一l034):28-38.I1】SchwarzRE.IndexingofgreeningandexocortisthroughfluorescentmarkersubstancesC.In:Proceedingsofthe4ConferenceoftheInternationalOrganizationofCitrusVirologists,USA:UniversityofFloridaPress,1968,4:1ll2412】NarianiTK,RaychaudhufiSP,BhallaRB.GreeningvirusofcitrusinIndiaJ.IndianPhytopathology

20、,1967,20:146一l50.13】LaflecheD,BoveJM.Mycoplasmatypestructuresinorangeleaveswithgreeningdisease叨.Fruits,1970,25:455465.14】林尤建,高日霞.應(yīng)用FBA染色法觀察柑桔黃龍病病株中的病原難培養(yǎng)細(xì)菌J.福建農(nóng)學(xué)院,1990,19(1):l一6.15】GamierM,IskraML,BoveJM.Monoclonalantibodiesagainstthebacterial-likeorganismassociatedwithcitrusgreeningdiseaseJ.Microbi

21、ology,1987,l38(6):639650.16】VillechanouxS,GamierM,RenaudinJ,eta1.DetectionofseveralstrainsofthebacteriumLikeorganismofcitrusgreeningdiseasebyDNAprobesJ.CurrentMicrobiology,1992,24:8995.17】HocquelletA,BoveJM,GamierM.Productionandevalvationofnon-radioactiveprobesforthedetectionofthetwo''Candid

22、atusLiberobacter''speciesassociatedwithcitrushuanglongbinggreeningJ.MolecularandCellProbes,1997,11(6):433438.18】鄧曉玲,梁志慧,唐偉文.快速檢測柑桔黃龍病病原的研究J.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),1999,20(1):l一4.19】JagoueixS,BoveJM,GamieM.Thephloemlimitedbacteriumofgreeningdiseaseofcitrusisamemberoftheo/.一subdivisionoftheProteobacteriaJ.IntemationalJo