細(xì)胞間粘附分子-1表達(dá)水平對心肌再灌注損傷的影響及N-乙酰半胱氨酸的保護(hù)作用

1、    細(xì)胞間粘附分子-1表達(dá)水平對心肌再灌注 損傷的影響及N-乙酰半胱氨酸的保護(hù)作用        摘要：目的探討細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)表達(dá)與中性粒細(xì)胞(PMNs)浸潤與心肌缺血再灌注損傷(IRI)的關(guān)系并觀察N-乙酰半胱氨酸(NAC)對IRI的保護(hù)效果。方法大鼠116只，分設(shè)：(1)缺血再灌注(IR)組；(2)IR+NAC組；(3)假手術(shù)對照組，并分設(shè)再灌注1、3、6、12、24 h時(shí)相點(diǎn)。取缺血心肌用原位雜交和免疫組織化學(xué)檢測ICAM-1 mRNA及其

2、蛋白表達(dá)水平，用酶法測定PMNs浸潤數(shù)，TTC染色法測心肌梗死范圍。結(jié)果心肌再灌注時(shí)，ICAM-1表達(dá)明顯增高，其mRNA表達(dá)至6 h達(dá)高峰，而蛋白質(zhì)表達(dá)水平、PMNs浸潤數(shù)和梗死范圍改變于1224 h達(dá)高峰，三者間呈顯著正相關(guān)，但I(xiàn)CAM-1 mRNA與后三者間無明顯相關(guān)性。IR+NAC組上述指標(biāo)于再灌注時(shí)雖也明顯增高，但比IR組明顯減輕，除ICAM-1蛋白質(zhì)表達(dá)于再灌注3 h前無顯著變化外，其余P均0.05或0.01。結(jié)論心肌IR時(shí)，ICAM-1參與介導(dǎo)了PMNs對組織細(xì)胞的粘附、浸潤和IRI的發(fā)生、發(fā)展；NAC可通過抑制ICAM-1的表達(dá)而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：細(xì)胞粘附；心肌缺血；再

3、灌注損傷Influence of expression of intercellular adhesion molecule-1 on myocardial ischemic reperfusion injury and cardiac protective effect of N-acetylcysteineCHEN YunzhenHE Guoxiang, et al.（Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China）SI Li

4、angyi（Southwest Hospital, Chongqing 400038, China）Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) on myocardial ischemic reperfusion injury (IRI), myocardial infiltration of polymorphonuclear neutrophils(PMNs) and infarction size, and the car

5、diac protective effect of N-acetylcysteine(NAC). MethodsOne hundred and sixteen rats were divided into three groups: IR, IR+NAC and sham-group. The ischemic myocardial samples were studied at 1,3, 6,12, 24 hours after ischemic reperfusion (IR). The levels of expression of ICAM-1 mRNA were evaluated

6、by in situ hybridization and the protein by immunocytochemistry. The numbers of infiltrated PMNs were measured with MPO enzyme marker method and the myocardial infarction area was evaluated by TTC staining method. ResultsAfter IR, myocardial levels of expression of ICAM-1 mRNA were increased signifi

7、cantly and reached a peak at 6 h; but the ICAM-1 protein peaked during 12-24 h. Number of PMNs and infarction size also increased and peaked after reperfusion 12-24 h. Close positive correlation (P<0.05) was found between the levels of expression of ICAM-1 protein, PMNs infarction area of the myo

8、cardium. In IR+NAC group, all of the indices were increased after IR, but the levels of increase in IR+NAC group were significantly lower (P<0.05 or 0.01) as compared with group IR (P<0.05-0.01). ConclusionThe findings indicate that PMNs adhesion and infiltration induced by ICAM-1 is implicate

9、d in the development of myocardial IRI. NAC could protect the myocardium from IRI by partially blocking the expression of ICAM-1.Key words：Cell adhesion;Myocardial ischemia;Reperfusion injury心肌缺血再灌注(ischemic reperfusion, IR)時(shí)，中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils, PMNs)對缺血心肌的浸潤可引起并加劇心肌細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡已被證實(shí)

10、1。但PNMs的觸發(fā)激活機(jī)制仍未徹底闡明；近年的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)在介導(dǎo)PMNs參與的缺血再灌注損傷中起到了重要作用2。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠心肌缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury, IRI)模型，觀察心肌缺血再灌注時(shí)ICAM-1 mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)規(guī)律及與PMNs浸潤和IRI的關(guān)系，從分子水平探討心肌IRI的發(fā)生機(jī)制并觀察N-乙酰半脫氨酸(N-acetylcysteine, NAC)對IRI的保護(hù)效果。材料與方法一、主要試劑鼠ICAM-1 cDNA質(zhì)粒(美國加州西北大學(xué)

11、分子及細(xì)胞生物學(xué)系Mayo博士饋贈(zèng))，限制性內(nèi)切酶EcoRI、限制性內(nèi)切酶Kpn I(德國寶靈曼公司)，ICAM-1單克隆抗體(美國R & D公司)，SP免疫組織化學(xué)測試藥盒(福州邁新公司)，HTAB，O-dianisidine, TTC, NAC(Sigma公司)，其余試劑均為分極純級(jí)。二、動(dòng)物模型制作及實(shí)驗(yàn)分組Wistar大鼠116只，體重250300克，雌雄不拘，隨機(jī)分設(shè)缺血再灌注組(IR組)，IR+NAC治療組和假手術(shù)對照組：IR組和IR+NAC組均先缺血1 h，然后設(shè)再灌注1、3、6、12、24 h共5個(gè)時(shí)相點(diǎn)：對照組只設(shè)12 h一個(gè)時(shí)相點(diǎn)作總體對照。每組各6只大鼠，心肌缺血

12、再灌注損傷模型參照方喜業(yè)3方法加以改進(jìn)，以收緊結(jié)扎線后心電I導(dǎo)聯(lián)或左前胸導(dǎo)聯(lián)融合的ST-T抬高，結(jié)扎線放松后抬高的ST-T下降1/2以上為模型成功。治療組于缺血10 min腹腔注射NAC 160mg/kg。對照組只埋線不結(jié)扎。于各相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)殺死動(dòng)物取心臟將缺血區(qū)心肌分為A、B兩片待測。另用50只大鼠按以上分組，每組5只，測定心肌梗死范圍。三、指標(biāo)檢測1.ICAM-1 mRNA原位雜交：參照蔡文琴等4方法，制備感受態(tài)JM109大腸桿菌，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增；裂解細(xì)菌后離心，分離純化質(zhì)粒DNA，再用EcoR I和Kpn I兩種限制性內(nèi)切酶雙切質(zhì)粒cDNA，經(jīng)電泳分離和透析得到高純度的cDNA

13、探針片段。用地高辛隨機(jī)引物法標(biāo)記cDNA探針。心肌作冰凍切片行原位雜交24 h(45孵育)；加抗地高辛抗體后NBT/BICP顯色，封片。結(jié)果用CMIAS007計(jì)算機(jī)醫(yī)學(xué)像分析儀處理，單位以面密度(目標(biāo)總面積/統(tǒng)計(jì)場總面積)表示。2.ICAM-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平測定4：取待測心肌冰凍切片用SP免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行，DAB顯色：結(jié)果用CMIAS007計(jì)算機(jī)醫(yī)學(xué)像分析儀處理，單位以面密度表示。3.心肌中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)測定：參照Bradley等建立的髓過氧化物酶(MPO)法測定心肌中的中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量5。4.心肌梗死范圍測定6：用TTC染色法進(jìn)行，以梗死心肌與左室重量的百分比表示梗死范圍。數(shù)據(jù)資料以

14、±s表示，采用Origin統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析，直線擬合程序處理數(shù)據(jù)，以P0.05差異有顯著性，P0.01差異有非常顯著性。結(jié)果一、缺血再灌注時(shí)心肌ICAM-1 mRNA表達(dá)規(guī)律及NAC對表達(dá)的影響IR組和IR+NAC組于心肌缺血再灌注1 h ICAM-1 mRNA表達(dá)均明顯增加，再灌注6 h達(dá)高峰，以后逐漸下降，至24 h仍維持較高的表達(dá)水平。與對照組比較，P均0.050.01；雖然IR+NAC組的ICAM-1 mRNA表達(dá)于缺血再灌注時(shí)有顯著的增加，但程度較IR組明顯輕，P均0.050.01(1)。1心肌再灌注(IR)時(shí)NAC對ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響二、缺血再灌注

15、時(shí)心肌ICAM-1蛋白表達(dá)變化規(guī)律及NAC的影響兩實(shí)驗(yàn)組于缺血再灌注后ICAM-1蛋白質(zhì)的表達(dá)均呈進(jìn)行性增加，再灌注3 h后其表達(dá)速度明顯加快，于再灌注12 h后又有所減慢，至24 h仍未見有下降趨勢。IR+NAC組于再灌注3 h后與IR組比較，其增加的程度顯著減低，P0.01(2)。2再灌注時(shí)NAC對ICAM-1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響三、缺血再灌注心肌中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)變化規(guī)律及NAC的影響心肌缺血再灌注1 h，IR組中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量即已明顯增加，以后呈進(jìn)行性增高，再灌注12 h達(dá)峰值，至24 h仍無下降趨勢。IR+NAC組的變化規(guī)律類似IR組，但程度則明顯低于IR組，兩組間各時(shí)相點(diǎn)比較，P均0.

16、01。四、NAC對缺血再灌注心肌梗死范圍的影響隨著心肌缺血再灌注時(shí)間的推移，IR組和IR+NAC組的梗死范圍均呈進(jìn)行性增加，IR+NAC組于灌注36 h后梗死范圍的增加得到明顯抑制，而單純IR組則于12 h后梗死范圍的擴(kuò)展速度才有所減緩；各相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)兩組間比較，心肌梗死范圍IR+NAC組明顯較IR組縮小，P0.01(3)。3缺血再灌注時(shí)NAC對心肌梗死范圍的影響五、各指標(biāo)間的相關(guān)分析心肌缺血再灌注時(shí)，ICAM-1 mRNA表達(dá)與中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量變化之間無明顯相關(guān)(r=0.7342)，P0.05；但I(xiàn)CAM-1 蛋白質(zhì)表達(dá)與心肌組織中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量的變化及心肌梗死范圍的變化之間呈顯著正相關(guān)(

17、r=0.7985和0.8673)，P0.05；且中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)與心肌梗死范圍的變化之間呈顯著正相關(guān)(r=0.9317)，P0.05。討論為證實(shí)細(xì)胞粘附分子在介導(dǎo)中性粒細(xì)胞對缺血組織的粘附、浸潤過程中的作用，Seekamp等7用ICAM-1的激活劑白介素-1和腫瘤壞死因子刺激組織細(xì)胞，結(jié)果使ICAM-1的表達(dá)增加并導(dǎo)致中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附增加，組織中的中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)也增多，組織細(xì)胞損傷加劇。當(dāng)用ICAM-1的單克隆抗體以阻斷其效應(yīng)時(shí)，大鼠缺血再灌注肝組織的中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)、氧自由基產(chǎn)物均明顯減少，生存率明顯增加8。當(dāng)再灌注10 h時(shí)，位于血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板的細(xì)胞粘附分子表達(dá)即已明顯升

18、高并介導(dǎo)血流中的中性粒細(xì)胞靠邊、與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，促進(jìn)其向血管外組織浸潤9。有研究顯示缺血再灌注時(shí)ICAM-1 mRNA的表達(dá)高峰在4 h左右，其蛋白質(zhì)的表達(dá)高峰在12 h左右10。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ICAM-1 mRNA于再灌注后1 h即已顯著增高，至6 h達(dá)高峰，蛋白質(zhì)表達(dá)于1224 h達(dá)高峰，表明心肌缺血再灌注時(shí)ICAM-1 蛋白質(zhì)激活持續(xù)時(shí)間較mRNA長，這也正是中性粒細(xì)胞能較長時(shí)間保持激活狀態(tài)的原因之一。本結(jié)果還顯示ICAM-1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平與心肌組織中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)和心肌梗死范圍之間有良好的相關(guān)性；但后二者與ICAM-1 mRNA表達(dá)水平之間無顯著相關(guān)性，這是因?yàn)镮CAM-1 mRNA

19、的表達(dá)持續(xù)時(shí)限較ICAM-1蛋白質(zhì)短，達(dá)高峰的時(shí)間較其早，而發(fā)揮病理生理效應(yīng)是ICAM-1 的蛋白質(zhì)，故其mRNA表達(dá)與其蛋白質(zhì)介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤之間就存在一個(gè)時(shí)間差。本實(shí)驗(yàn)用ICAM-1 抑制劑NNAC干預(yù)，結(jié)果再灌注6 h的ICAM-1 mRNA表達(dá)較IR組減低59.5%，PMNs浸潤數(shù)減少32.4%，心肌梗死范圍縮小了46.6%；且兩組間各時(shí)相點(diǎn)各指標(biāo)間比較差異均有顯著性；提示NAC對心肌IRI確有保護(hù)作用，這種作用與抑制ICAM-1表達(dá)有關(guān)。雖然NAC可抑制PMNs浸潤數(shù)和縮小梗死范圍，但與其抑制ICAM-1表達(dá)的程度并不成比例，因而從另一個(gè)側(cè)面提示PMNs的激活途徑并非僅ICAM-

20、1通道。我們以前的研究11證實(shí)心肌缺血再灌注損傷的致?lián)p因素并不是單一的，特別是在再灌注早期，鈣超載，氧自由基，其它細(xì)胞因子等因素均對中性粒細(xì)胞的激活和再灌注損傷產(chǎn)生直接或間接的影響，但無疑ICAM-1在中性粒細(xì)胞的激活及心肌再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的作用；NAC介導(dǎo)的抗細(xì)胞粘附分子療法可望成為抗缺血再灌注損傷的又一有效療法。本文編輯：諸永康作者單位：司良毅（西南醫(yī)院老年心血管病400038 重慶）何國祥（西南醫(yī)院老年心血管病心內(nèi)科400038 重慶）王國超（西南醫(yī)院老年心血管病心內(nèi)科400038 重慶）陳運(yùn)貞（重慶醫(yī)科第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科）參考文獻(xiàn)：1Kuros I, Anderson

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22、:90-93. 3方喜業(yè)，主編. 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué). 第一版. 北京：人民衛(wèi)生出版社. 1995. 291-295. 4蔡文琴，王伯云，主編. 實(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)與核酸分子雜交技術(shù). 第一版. 成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1994. 406-421. 5羅武生，郭兆貴. 用髓過氧化物酶法測定心肌組織中的中性粒細(xì)胞. 中國藥物學(xué)通報(bào)，1990，6：264-570. 6Evans RC, Val-mejias JE, Kulevich J, et al. Evaluation of a rat model for assessing iintervention to salvage ischaemic myocardium: effects