銀杏葉提取物誘導(dǎo)血紅素氧合酶-1表達(dá)抗缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的研究

1、銀杏葉提取物誘導(dǎo)血紅素氧合酶-1表達(dá)抗缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的研究         08-05-26 14:53:00     作者：張英 黃維義 陳蓉    編輯：studa20【關(guān)鍵詞】  銀杏葉提取物；,血紅素氧合酶-1；,再灌注損傷；,凋亡摘要：目的探討銀杏葉提取物（EGb761）誘導(dǎo)血紅素氧合酶-1（HO-1）表達(dá)抗缺血再灌注損傷（IRI）后心肌細(xì)胞凋亡的效果及其機(jī)理。方法48只兔隨機(jī)均分為單純IRI組、EGb

2、761組、EGb761+ZnPP組，分別預(yù)先給予等容積的生理鹽水，EGb761，EGb761+ZnPP腹腔內(nèi)注入。24 h后，每組任選8只處死，檢測心肌細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)及活性，余兔結(jié)扎冠脈左前降支使心肌缺血40 min，再灌注4 h，取缺血心肌檢測中性粒細(xì)胞浸潤、丙二醛（MDA）含量、Bax蛋白與Bcl-2蛋白表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果與單純IRI組及EGb761+ZnPP組比較，EGb761組HO-1表達(dá)及活性均明顯升高，中性粒細(xì)胞浸潤及MDA含量明顯降低，Bax 增加而Bcl-2降低，心肌細(xì)胞AI顯著減少(均為P<0.01)。與單純IRI組比較，EGb761+ZnPP組H

3、O-1表達(dá)增加但活性降低(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)，其余指標(biāo)均無顯著差異。結(jié)論EGb761能明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)，并通過HO-1的抗炎、抗氧化等作用下調(diào)Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，從而顯著抑制IR損傷后心肌細(xì)胞凋亡。關(guān)鍵詞：銀杏葉提取物；  血紅素氧合酶-1；  再灌注損傷；  凋亡Abstract：ObjectiveTo explore the protective effects and mechanism of heme oxygenase-1 (HO-1) expression induced by ex

4、tract of Ginkgo biloba(EGb761) against cardiomyocyte apoptosis from ischemia reperfusion injury(IRI).Methods48 rabbits were randomly divided into simple IR group, EGb761 group and EGb761+ ZnPP group. Each rabbit in different groups was intraperitoneal injected with saline(5ml), EGb761(10mg/kg), EGb7

5、61(10mg/kg)+ ZnPP(7.5mg/kg) respectively. 24 hours later, 8 rabbits in each group were killed to measure myocardial HO-1 expression and HO-1 activity. Other rabbits were subjected for 40min of myocardial ischemia by ligation of left anterior descending coronary artery followed by 4h of reperfusion.

6、The neutrophil infiltration, myocardial malonaldehyde(MDA) content, Bax and Bcl-2 protein expression, cardiomyocyte apoptosis index(AI) in ischemia areas were detected.ResultsCampared with simple IRI group and EGb761+ ZnPP group, the expression and activity of myocardial HO-1 increased significantly

7、, the neutrophil infiltration and MDA content decreased. Bax expression increased and AI and Bcl-2 level decreased in EGb761 group(P<0.01 respectively). Compared with simple IRI group, EGb761+ ZnPP group showed higher myocardial HO-1 expression but lower HO-1 activity (P<0.01), while the MDA c

8、ontent increased (P<0.05),but the neutrophil infiltration, Bax and Bcl-2 expression and AI showed no significant difference.ConclusionEGb761 could induce HO-1 overexpression, through its antiinflammatory and antioxidative action to upregulate Bcl-2 and downregulate Bax, thus protect against cardi

9、omyocyte apoptosis from IRI.Key words：Extract of Ginkgo biloba;  Heme oxygenase-1;  Reprfusion injury;  Apoptosis     銀杏葉提取物(EGb761)被廣泛用于缺血性心、腦血管病的防治并取得了良好效果。一般認(rèn)為，EGb761抗缺血損傷的效果主要是源于其有效成分銀杏黃酮直接清除自由基的作用和萜類內(nèi)酯的抗血小板活化作用1。有研究揭示，銀杏葉提取物中富含的銀杏黃酮成分還能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶-1(HO-1)2。

10、根據(jù)研究，采用基因轉(zhuǎn)染的方法促使大鼠心肌細(xì)胞特異高表達(dá)HO-1能抑制缺血再灌注損傷(IRI)心肌細(xì)胞凋亡3。銀杏葉提取物能否誘導(dǎo)在體心肌細(xì)胞高表達(dá)HO-1并據(jù)此抑制IRI后心肌細(xì)胞凋亡，迄今少見這方面的研究報(bào)道。我們擬對此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究并初步探討其中的作用機(jī)制。1  材料與方法1.1  分組、動物模型制作及取材選用健康日本大耳白兔24只，體重2.12.4 kg，雌雄不拘，隨機(jī)均分為單純IRI組、EGb761組、EGb761+ZnPP3組，每組16只。各組兔預(yù)先分別給予相等容積（5 ml）的生理鹽水、EGb761(10 mg/kg，貴州益佰制藥股份有限公司產(chǎn)品)、EGb761(

11、10 mg/kg)+ZnPP(7.5 mg/kg，Sigma公司產(chǎn)品)腹腔內(nèi)緩慢注入，兔自由攝食和進(jìn)水。24 h后，每組先任選8只活殺，取左室前壁心肌檢測HO-1表達(dá)及活性，余兔經(jīng)耳緣靜脈注入3%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定，沿胸骨左緣切開，小心剪開心包，保持胸膜完整以使兔能維持自主呼吸，在距冠脈左前降支根部23 mm處穿線打活結(jié)，拉緊絲線使心肌缺血（心肌呈紫紅色）40 min，隨即松開絲線使心肌再灌注（心肌恢復(fù)紅色）4 h，迅速處死兔并摘取心臟，剪下左心室，生理鹽水漂洗后-80凍存待測各項(xiàng)指標(biāo)。1.2  HO-1蛋白表達(dá)的免疫組化分析及HO-1活性測定取左室前壁心肌采用SABC免疫組化

12、法（抗體購于武漢博士德公司）檢測心肌細(xì)胞中HO-1的表達(dá)，顯微鏡下觀察見細(xì)胞漿染成褐色者即為HO-1陽性表達(dá)細(xì)胞。用CD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)，在200倍鏡下隨機(jī)選測5個(gè)視野的平均光密度值代表HO-1蛋白表達(dá)量。另取部分左室前壁心肌加入蔗糖-Tris緩沖液制備勻漿，差速離心法分離微粒體，考馬亮蘭法測定蛋白濃度，根據(jù)HO-1降解血紅素生成膽紅素的原理，參考何潔4的方法，以每毫克蛋白每小時(shí)催化生成膽紅素的nmol數(shù)代表HO-1活性（nmolmg-1h-1）。1.3  中性粒細(xì)胞浸潤檢測參照Mullane6的方法，采用測定髓過氧化物酶(MPO) 活性的方法代表缺血區(qū)心肌中性粒細(xì)胞浸潤量，

13、以25下每分鐘分解1 mol過氧化物作為1u。1.4  丙二醛(MDA)含量測定取缺血區(qū)心肌采用硫代巴比妥法按試劑盒（購于南京建成生物研究所）說明書進(jìn)行測定。1.5  Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)的免疫組化分析取缺血區(qū)心肌常規(guī)石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，采用SP免疫組化法參照試劑盒（購自DAKO公司）說明書檢測Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)，檢測Bax以AEC顯色，胞漿中有紅色顆粒者為Bax表達(dá)陽性細(xì)胞，檢測Bcl-2以DAB顯色，胞漿中有棕褐色顆粒者為Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞。用CD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)，在200倍鏡下隨機(jī)選測5個(gè)視野的平均光密度值代表Bax，Bc

14、l-2蛋白表達(dá)量。1.6  心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)檢測取缺血區(qū)心肌常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟至水，使用TUNEL法凋亡檢測試劑盒（購自Bochringer Mannheim公司）檢測心肌細(xì)胞凋亡。光鏡200倍下觀察，核染成棕色者為凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，以凋亡細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比作為心肌細(xì)胞AI。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以 ±s表示，組間比較采用F+q檢驗(yàn)。2  結(jié)果2.1  心肌細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)量及HO-1活性比較免疫組化檢測顯示，單純IRI組、EGb761+ZnPP組及EG

15、b761組心肌細(xì)胞胞漿分別呈淺褐色、褐色及深褐色，3組間HO-1蛋白平均光密度值及HO-1活性均有明顯差異。結(jié)果見表1。2.2  心肌中性粒細(xì)胞浸潤及MDA含量比較EGb761組PMO活性及MDA含量均較其余兩組顯著降低，EGb761+ZnPP組MDA含量明顯高于單純IRI組，但PMO活性與單純IRI組無明顯差異。2.3  Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)及心肌細(xì)胞AI比較單純IRI組和EGb761+ZnPP組Bax表達(dá)陽性細(xì)胞較多，Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞較少，有大量凋亡的心肌細(xì)胞（圖1，圖2）。EGb761組則是Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞多而Bax表達(dá)陽性細(xì)胞及凋亡的心肌細(xì)胞均較少（圖3），Bax，Bcl-2蛋白平均光密度值及心肌細(xì)胞AI在EGb761組與單純IRI組和EGb761+ZnPP組比較均有顯著差異，而在單純IRI組與EGb761+ZnPP組之間比較則無明顯差異。見表1。TUNEL標(biāo)記法 ×2