典型病例觀察

1、動物疾病學(xué)實驗指導(dǎo)實驗一 典型病例觀察實驗?zāi)康模和ㄟ^觀察動物典型病例錄像片，加深對動物疾病的了解，加深對疾病典型癥狀的觀察，達(dá)到理論與實踐結(jié)合，增強(qiáng)正確診斷和治療典型病例的能力。實驗內(nèi)容與基本要求：實驗觀察內(nèi)容：磁籠防治牛創(chuàng)傷性網(wǎng)胃炎、胸膜炎、異物性肺炎、要求：認(rèn)真觀看典型病例的發(fā)病原因，臨床癥狀，防治方法。 按實驗報告的要求書寫好典型病例觀察的實驗報告主要器材與藥品 電腦 典型病例視頻教學(xué)片實驗二 藥敏試驗抗菌藥物在疾病防治上已得到了廣泛的使用,但是對某種抗菌藥物長期或不合理地使用,可引起這些細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,。如果盲目地濫用抗菌藥物,不僅造成藥物的浪費(fèi),同時也貽誤了治療時機(jī)。藥物敏感試驗,是

2、一項藥物體外抗菌作用的測定技術(shù),通過本試驗,可選用最敏感的藥物進(jìn)行臨診治療, 同時也可根據(jù)這一原理,測定抗菌藥物的質(zhì)量,防偽劣假冒產(chǎn)品和過期失效藥物。實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)了解細(xì)菌對藥物的敏感試驗的常用方法。學(xué)習(xí)對藥物的敏感試驗的操紙片法作方法。實驗內(nèi)容與基本要求：2.1用經(jīng)火焰滅菌的鉑耳或接種環(huán)挑起待試細(xì)菌的純培養(yǎng)物，以劃線接種方式將挑取的細(xì)菌涂布到普通瓊脂平板或鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基表面。也可以挑取待試細(xì)菌于少量滅菌生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌的棉拭子沾取菌液涂布到上述培養(yǎng)基表面，盡可能涂布的致密而均勻。2.2用滅菌尖頭鑷子，鑷取己制備好的各種干燥抗菌紙藥片。分別密貼到上述培養(yǎng)基表面，為了抗菌紙藥

3、片與培養(yǎng)基表面密貼，可用鑷子輕按下紙片。紙片在培養(yǎng)基上的分布，一般可為中央貼一種紙片，外周以等距離貼若干種紙片，這樣一個直徑為90mm平板可貼67個抗菌藥紙片。如果藥敏紙片上沒有標(biāo)記，在每貼一種紙片后，應(yīng)在平板底上用筆寫上其藥名或貼上標(biāo)簽。2.3將貼好紙片的平板底部在下，置37溫箱中培養(yǎng)24小時后，取出觀察效果。2.4藥敏試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑mm 敏感度20以上極敏1520高敏1014中敏10以下低敏0不敏感附：1.紙片法 各種抗菌藥物的紙片,市場有售,是一種直徑6毫米的圓形小紙片,要注意密封保存,藏于陰暗干燥處, 切勿受潮。注意有效期,一般不超過6個月。 (1)試驗材料 經(jīng)分離和鑒定后的純

4、培養(yǎng)菌株(例如大腸 桿菌、鏈球菌等),營養(yǎng)肉湯,瓊脂平皿,棉拭子,鑷子,酒精燈, 藥敏紙片若干。 (2)試驗步驟 將測定菌株接種到營養(yǎng)肉湯中,置37條件下培養(yǎng)12小時,取出備用。用無菌棉拭子蘸取上述菌液,均勻涂于瓊脂平皿上。待培養(yǎng)基表面稍干后,用無菌小鑷子分別取所需的藥敏紙片均勻地貼在培養(yǎng)基的表面, 輕輕壓平,各紙片間應(yīng)有一定的距離,并分別作上標(biāo)記。將培養(yǎng)皿置37溫箱內(nèi)培養(yǎng)1218小時后,測量各種藥敏紙片抑菌圈直徑的大小（以毫米表示）。 2.試管法 本法較紙片法復(fù)雜,但結(jié)果較準(zhǔn)確、可靠。此法不僅能用于各種抗菌藥物對細(xì)菌的敏感性測定,也可用于定量檢查。 (1)試驗方法 取試管10支,排放在試管架

5、上,于第一管中加入肉湯1.9毫升,其余各管均各加1毫升。吸取配好的抗菌藥物0.1毫升,加入第一管,混合后吸取1毫升放入第二管,混合后再由第二管移1毫升到第三管,如此倍比稀釋到第九管,從中吸取1毫升棄掉,第十管不加藥物作為對照。然后各管加入幼齡試驗菌0.05毫升(培養(yǎng)18小時的菌液,Ig 1000稀釋)。置37溫箱內(nèi)培養(yǎng)1824小時觀察結(jié)果。必要時也可對每管取0.2毫升分別接種于培養(yǎng)基上,經(jīng)12小時培養(yǎng)后計數(shù)菌落。 (2)結(jié)果判定培養(yǎng)18個小時后,凡無菌生長的藥物最高稀釋管,即為該菌對藥物的敏感度。若藥物本身渾濁而肉眼不易觀察的,可將各稀釋度的細(xì)菌涂片鏡檢,或計數(shù)培養(yǎng)皿上的菌落。 3.瓊脂擴(kuò)散法

6、本法是利用藥物可以在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散的原理,進(jìn)行抗菌試驗,其目的是測定藥物的質(zhì)量,初步判斷藥物抗菌作用的強(qiáng)弱,用于定性,方法較簡便。 (1)試驗材料 被測定的抗菌藥物(例如青霉素,選擇不同廠家生產(chǎn)的幾個品種,以作比較),試驗用的菌株(例如鏈球菌),營養(yǎng)肉湯,營養(yǎng)瓊脂平皿,棉拭子,微量吸管等。 (2)試驗步驟 將試驗細(xì)菌接種到營養(yǎng)肉湯中,置 37溫箱培養(yǎng)12小時,取出備用。用無菌棉拭子蘸取上述菌液均勻涂于營養(yǎng)瓊脂平皿上。用各種方法將等量的被測藥液(如同樣的稀釋度和數(shù)量),置于含菌的平板上,培養(yǎng)后, 根據(jù)抑菌圈的大小,初步判定該藥物抑菌作用的強(qiáng)弱。藥物放置的方法有多種:第一,直接將藥液滴在平板上;

7、第二,用濾紙片蘸藥液置于含菌的平板上;第三,在平板上打孔(用瓊脂沉淀試驗的打孔器),然后將藥液滴入孔內(nèi);第四,先在無菌平板上劃出一道溝,在溝內(nèi)加入被檢的藥液,溝上方劃線接種試驗菌株。以上藥物放置方法可根據(jù)具體條件選擇使用。 主要器材與藥品器材：試管架、試管、平皿、接種環(huán)、鑷子、普通瓊脂培養(yǎng)基或特殊培養(yǎng)基等。藥品：藥敏試紙，被試細(xì)菌。實驗三 產(chǎn)科疾病的觀察實驗?zāi)康模和ㄟ^觀察動物產(chǎn)科疾病病例錄像片，加深對產(chǎn)科疾病的了解，加深對產(chǎn)科疾病典型癥狀的觀察，達(dá)到理論與實踐結(jié)合，增強(qiáng)正確診斷和治療典型病例的能力。實驗內(nèi)容與基本要求：實驗觀察內(nèi)容：動物產(chǎn)科疾病病例錄像片要求：認(rèn)真觀看典型病例的發(fā)病原因，臨床癥

8、狀，防治方法。 按實驗報告的要求書寫好典型病例觀察的實驗報告主要器材與藥品 電腦 典型動物產(chǎn)科病例視頻教學(xué)片實驗四 中毒性疾病觀察觀察有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的臨床癥狀實驗?zāi)康模河^察有機(jī)磷農(nóng)藥敵百蟲中毒癥狀。學(xué)習(xí)阿托品及解磷定的救治作用及膽堿脂酶活力的測定方法。實驗內(nèi)容與基本要求：2.1取家兔現(xiàn)兩只。以甲、乙編號稱重，觀察下列指標(biāo)，活動情況、呼吸、瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌張力及有無肌肉震顫等。2.2將兩兔分別固定于兔箱內(nèi)，以蘸有二甲苯或酒精棉球擦拭耳外緣靜脈，使血管擴(kuò)張，當(dāng)其充血明顯時，用刀片橫斷耳外緣靜脈刀口不要過大過深，讓血液自然滴入試管中(管中預(yù)先滴入2滴肝素，自然干燥備)， 并輕輕振蕩試管

9、，防止凝血，供側(cè)定正常膽堿脂酶活性用。2.3分別給甲乙兩兔靜脈注射5%敵百蟲2.0ml/kg,按前述觀察并記錄中毒癥狀，待中毒癥狀明顯時，依上法采血供側(cè)定中毒后膽堿脂酶活性用。主要器材及藥品器材：恒溫水浴、分光光度計、試管架、中試管、吸管、濾紙、漏斗、兔保定箱、注射器、測瞳尺、刀片、棉球。藥品：0.1%阿托品、5%敵百蟲、1%肝素、2.5%解磷定、PH7.2磷酸鹽緩沖液、0.007mol/L乙酰膽堿、堿性羥胺溶液、4N鹽酸、10%三氯化鐵。實驗五 血凝和血凝抑制試驗以新城疫為例掌握試驗原理步驟及應(yīng)用實驗?zāi)康模?、 掌握血凝及血凝抑制試驗的基本方法及原理2、 掌握雞新城疫的試驗室診斷技術(shù)。實驗內(nèi)

10、容與基本要求：1、 血凝試驗：常多用感染雞胚液進(jìn)行，凝集價可達(dá)1:160-1:640也可采用急性病例的組織浸出液，但凝集價較低。本病毒可凝集許多動物的紅細(xì)胞，但凝集性能不夠穩(wěn)定，故通常作血凝試驗時都采用雞的紅細(xì)胞采血部位為心臟或翅靜脈，取血后加抗凝劑或脫纖維，置于離心機(jī)中搖轉(zhuǎn)加生理鹽水洗滌三次后，將濃縮的紅細(xì)胞配成1%生理鹽水懸液，即可應(yīng)用。 操作方法見實習(xí)指導(dǎo)。凡能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)，稱為該病毒的血凝滴度。2、 血凝抑制試驗：單純地使用血凝試驗還不能作出明確的診斷，因為還有其它病原也能引起紅細(xì)胞凝集，如引起慢性呼吸道病的禽敗血支原體。所以需用已知的抗血清作血凝抑制試驗。以鑒

11、別病毒。也可用已知病毒來測定病雞血清中的抗體，而得明確的診斷。但不適于急性病例，通常要在感染后的5-10天，或出現(xiàn)呼吸癥狀后的2天，血清中的抗體到一定水平。反就可用試管法，操作方法見實習(xí)指導(dǎo)。主要器材與藥品器材：離心機(jī)、試管架、試管、注射器、針頭、感染雞胚等。藥品：0.85%生理鹽水、1%紅細(xì)胞渾懸液、血清、4單位病毒。附：一、 雞新城疫 診斷技術(shù)規(guī)程1 范圍 本規(guī)程引用GB16550-1996新城疫檢疫技術(shù)規(guī)范。 本規(guī)程規(guī)定了新城疫群體檢疫、個體檢疫、實驗室檢驗和檢疫后處理的技術(shù)規(guī)范。本規(guī)程適用于雞和其他可感染新城疫的禽類。2 群體檢疫 對養(yǎng)禽場、獨(dú)立飼養(yǎng)的禽群及外售、外運(yùn)的禽群施行檢疫。2

12、1 查明疫病背景 通過詢問獸醫(yī)人員或檢查疫病記錄，檢查被檢禽場（群、室）在過去的一年內(nèi)是否有出現(xiàn)過新城疫臨診病例，是否有與新城疫接觸史，周圍2km范圍內(nèi)是否發(fā)生過新城疫。22 查清免疫狀況 通過查驗免疫證明或查詢其他資料，檢查被檢群是否已按規(guī)定注射合格疫苗。如按規(guī)定免疫并正處于規(guī)定的保護(hù)期內(nèi)，禽只健康狀況良好，被認(rèn)為免疫合格。如免疫不符合規(guī)定要求，要以合格疫苗再次接種，隔離飼養(yǎng)觀察至群體抗體滴度達(dá)2523群體臨診檢查 首先作靜態(tài)檢查，讓禽群處于靜止?fàn)顟B(tài)，觀察營養(yǎng)狀況、精神狀態(tài)、呼吸、糞便、鼻和口腔分泌物有否異常。然后觀察禽只運(yùn)動狀況，有否跛行、共濟(jì)失調(diào)、痙攣等異?，F(xiàn)象。檢查中重點(diǎn)注意以下情況：

13、a.精神沉郁或無任何癥狀而死亡； b.體溫升高、食欲減退、精神委頓、產(chǎn)蛋減少或停止；c.口腔和鼻腔分泌物增多，素囊脹滿；d.呼吸困難、喉部發(fā)出“咯咯“聲（晚間較明顯）；e.下痢，糞便成綠色；f.偏頭轉(zhuǎn)頸，作轉(zhuǎn)圈運(yùn)動或共濟(jì)失調(diào)。 若發(fā)現(xiàn)疑似病例，按2.4條要求進(jìn)一步檢查，同時對全群隔離飼養(yǎng)。 24 病理解剖檢查對臨診疑似病例，應(yīng)全部或抽樣解剖，依據(jù)下述病變作出初步判斷：a.口腔、喉部有粘液，咽部粘膜出血；b.腺胃乳頭腫脹，擠壓后有豆腐渣樣壞死物流出，乳頭有散在的出血點(diǎn)；c.肌胃角質(zhì)下層有條紋或點(diǎn)狀出血、有時見不規(guī)則潰瘍，腺胃與肌胃交接處有出血斑、條；D小腸前段有大面積散在出血點(diǎn)，或腸粘膜有纖維性

14、壞死并形成假膜，假膜下出現(xiàn)紅色粗糙潰瘍；E盲腸和直腸皺褶處有出血 ，盲腸扁桃體（淋巴濾泡）出血壞死；F氣管粘膜充血、出血、氣管內(nèi)有粘液；G心冠脂肪、心外膜及心尖脂肪上有針尖狀小出血點(diǎn)。3個體檢疫31在無群體檢疫條件的場合，須進(jìn)行個體檢疫。個體檢疫合格的禽只一般供食用，如繼續(xù)飼養(yǎng)應(yīng)隔離3周，經(jīng)觀察無異常后，方準(zhǔn)與其它禽只混養(yǎng)。 查明是否來自疫區(qū)。 查驗免疫證明。 臨診檢查和病理解剖檢查4 實驗室檢驗4.1 下列情況進(jìn)行實驗室檢查a. 產(chǎn)地定期檢疫；b. 監(jiān)測免疫狀態(tài)；c. 疑似病雞的定性，或臨診及解剖檢查初步診斷為新城疫，需進(jìn)一步確診；d. 檢疫中發(fā)現(xiàn)重大疫情（如禽流感），須作鑒別診斷；e. 行

15、政主管部門、飼養(yǎng)單位、售購或爭議雙方要求進(jìn)行實驗室診斷。4.2 實驗室檢測方法a. 病毒分離鑒定試驗，見附錄A。b. 血凝抑制試驗，用于免疫監(jiān)測，見附錄B。5. 檢疫后的處理5.1 經(jīng)臨床檢查、解剖檢查和實驗室診斷等綜合判斷，確診為新城疫的禽群或禽只，按GB16548處理。5.2 經(jīng)初步診斷為新城疫可疑的禽群（禽只），按下述方法之一處理：a. 除將可疑禽只按5.1條處理外，全群隔離飼養(yǎng)，并進(jìn)行緊急免疫接種，如在接種后觀察期內(nèi)出現(xiàn)可疑禽只，亦按5.1條處理，觀察21天后，對臨床健康，免疫滴度達(dá)到25以上的禽只，經(jīng)體表消毒后按健康禽只對待。b. 經(jīng)初步診斷為新城疫可疑的禽群（禽只），在全部隔離飼養(yǎng)

16、的同時，對可疑禽只采樣作實驗室診斷，如確為新城疫者，全群即按5.1條處理。5.3 發(fā)生過新城疫的禽場在半年之內(nèi)，其禽只不準(zhǔn)出售、外運(yùn)。 附錄A 病毒分離鑒定試驗A1儀器設(shè)備注射器：1ml。注射針頭：55.5號。血凝試驗板：V型、96孔。微量移液器：50ul。恒溫箱。超凈工作臺或無菌室。A2試劑。無菌生理鹽水。青霉素。鏈霉素。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。A3樣品采集及處理A3.1活禽用氣管拭子和泄殖腔拭子（或糞）。A3.2死禽以腦為主；也可采心、肝、脾、腎、氣囊等組織。A3.3樣品用生理鹽水研成1：5乳液；拭子侵入23ml 生理鹽水中，反復(fù)吸擠壓至無水滴出，棄之。溶液中加入青霉素（使終濃度為1000單位/ m

17、l ）、鏈霉素（使終濃度為1mg/ml ）。泄殖腔拭子（或糞）樣品，青霉素、鏈霉素量提高5倍。然后調(diào)pH 7.07.4，37作用1h ，再1000r/分鐘離心10分鐘，取上清0.1ml，經(jīng)尿囊腔接種910日齡SPF雞胚。A4培養(yǎng)物的收集及檢測A4.1培養(yǎng)47天的尿囊液經(jīng)無菌采集后-20保存.A4.2尿囊液按附錄B作血凝試驗，并與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作血凝抑制試驗，確定有無 新城疫病毒繁殖。A4.3MDT（最小病毒致死量引起雞胚死亡的平均時間）的 測定：將新鮮尿囊液用生理鹽水連續(xù)10倍稀釋，10-610-9的 每個稀釋度接種5個910日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，37孵化。余下的病毒保存于4，8h后

18、以同樣方法接種第二批雞胚，連續(xù) 7天內(nèi)觀察雞胚死亡時間并記錄，測定出最小致死量，即引起被接種雞胚死亡的最大稀釋倍數(shù)。計算MDT。A4.4以MDT確定病毒的致病力強(qiáng)弱，4070h死亡為強(qiáng)毒，140h以上為弱毒。 附錄B 雞新城疫微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗B1儀器設(shè)備B1.1微量血凝板：V型、96孔。B1.2微型振蕩器。B1.3塑料采血管。B1.4移液器：50ul. B2試劑B2.1稀釋液pH7.07.2磷酸緩沖鹽水氯化鈉（GB126677） 170g磷酸二氫鉀（GB127477） 13.6g氫氧化鈉（GB62977） 3.0g蒸餾水 1000ml高壓滅菌，4保存，使用是作20倍稀釋。B2.2濃縮抗原

19、B2.3 0.5%紅細(xì)胞懸液采成年雞血，用20倍量磷酸緩沖鹽水洗滌34次，每次以2000r/min離心34分鐘，最后一次5分鐘，用磷酸緩沖鹽水配成0.5%懸液。B2.4標(biāo)準(zhǔn)陽性血清B3被檢血清每群雞隨機(jī)采2030份血樣，分離血清。采血法：先用三棱針刺破翅下靜脈，隨即用塑料管引流血液至68cm長。將管一端燒融封口，待凝固析出血清后以1000r/min離心5分鐘，剪斷塑料管，將血清倒入一塊塑料板小孔中，若需較長時間保存，可在離心后將凝血塊一端剪去，滴融化石蠟封口，于0oC保存。B4 操作方法B4.1 微量血凝試驗B 于微量血凝板（B1.1）的每孔中滴加稀釋液（B2.1）50ul，共滴四排。B 吸取

20、1:5稀釋抗原滴加于第一列孔，每孔50ul，然后由左至右順序倍比稀釋至第11列孔，再從第11孔各吸取50ul棄之。最后一列不加抗原作對照。B 于每孔加入0.5%紅細(xì)胞懸液（B2.3）50ul。B 置微型振蕩器（B1.2）上振蕩1分鐘，或手持血凝板繞圓圈混勻。B 放室溫下（1820oC）3040分鐘，根據(jù)血凝圖象判定結(jié)果。以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝滴度。每次四排重復(fù)，以幾何平均值表示結(jié)果。B 計算出含4個血凝單位的抗原濃度，按式（B1）進(jìn)行計算?？乖瓚?yīng)稀釋倍數(shù)=血凝滴度/4.(B1)B4.2 微量血凝抑制試驗B 先取稀釋液（B2.1）50ul，加入微量血凝板（B1.1）的第一孔

21、，再取濃度為4個血凝單位的抗原依次加入312孔，每孔50ul，第二孔加濃度為8個血凝單位的抗原50ul。B吸被檢血清(B3)50ul 于第1孔(血清對照)中,擠壓混勻后吸50ul 于第2孔,依次倍比稀釋至12孔,最后棄去50 ul.B置室溫(1820)下作用20分鐘.B滴加50ul 0.5%紅細(xì)胞懸液(B2.3)于各孔中,振蕩混合后,室溫下靜置3040分鐘,判定結(jié)果B每次測定應(yīng)設(shè)已知滴度的 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(B2.4)對照.B5結(jié)果判定B5.1在對照出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下,以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋度為該血清的血凝抑制滴度.B5.2若有10%以上的雞出現(xiàn)11(log2)以上的高血凝抑制滴度,說明

22、雞群已受新城疫強(qiáng)毒感染.B5.3若監(jiān)測雞群的免疫水平,則血凝抑制滴度在4(log2 )的雞群保護(hù)率為50%左右;在4(log2)以下的保護(hù)率達(dá)90%-100%;在4(log2)以下的 非免疫雞群保護(hù)率約為9%,免疫過的雞群約為43%.雞群的血凝抑制滴度以抽檢樣品的血凝抑制滴度的幾何平均值表示,如平均水平在4(log2 )以上,表示該雞群為免疫雞群.實驗六 瓊脂擴(kuò)散試驗 以法氏囊病為例掌握試驗原理步驟及應(yīng)用實驗?zāi)康模赫莆针u傳染法氏囊病瓊脂擴(kuò)散試驗，適用于雞傳染法氏囊病診斷和免疫抗體檢測。（二）實驗內(nèi)容與基本要求：瓊脂與免疫擴(kuò)散實驗21試劑抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。

23、22操作方法221瓊脂板的制備2211 pH6.4 0.01mol/LPBS液甲液:Na2HPO4.12H2O 3.85g, 加蒸餾水至1000ml 。乙液：KH2PO4 1.36g 加蒸餾水至1000ml .充分溶解后分別保存?zhèn)溆谩?.2 制板取甲液24ml,乙液76ml放于三角瓶中混合,加0.8g或1g瓊脂糖,8g氯化鈉,三角瓶在水浴中煮沸使瓊脂糖等融化,再加1% 硫柳汞1ml. 取直徑90mm的平皿,每個平皿中加20ml. 待凝固后放于冷藏冰箱中保存?zhèn)溆谩?3 打孔與加樣用直徑4mm的打孔器按六角形圖案打孔或用梅花型打孔器打孔。中心與周圍孔距離為3mm. 中心孔加滿抗原,周圍孔分別加滿待

24、檢血清和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,置濕盒中放于37 溫箱中過夜,經(jīng)24-48小時觀察結(jié)果。2.3結(jié)果判定當(dāng)抗原孔與陽性血清孔之間出現(xiàn)特異性沉淀線時,待檢血清孔與抗原孔之間也出現(xiàn)沉淀線,判為陽性,不出現(xiàn)沉淀線者判為陰性。主要器材與藥品器械:無菌接種箱、恒溫箱、平皿、直徑4mm的打孔器、藥品:法氏囊病抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、1% 硫柳汞、瓊脂糖、氯化鈉、（NY/SY1652000） 附:雞馬立克氏病診斷（NY/SY184-2000）1、范圍 本規(guī)程規(guī)定了雞馬立克氏病瓊脂免疫試驗，既用于檢測雞馬立克氏病的血清抗體，又能檢測其病毒抗原。 本規(guī)程適用于20日齡以上雞羽髓抗原檢測

25、和1月齡以上雞的抗體檢測。2、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗2.1材料準(zhǔn)備器材：1ml注射器，6-9號針頭，10X100mm小試管，直徑6-8mm,長約16cm的玻璃棒，微量移液器及滴頭，燒杯或磁缸，直徑85mm培養(yǎng)皿，孔徑4mm和3mm的打孔器。 瓊脂擴(kuò)散抗原，陽性血清，系凍干制品，使用時用蒸餾水恢復(fù)到原分裝量。由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。 瓊脂凝膠平板：用含8%氯化納的磷酸鹽緩沖液（0.01mol/LpH7.4）配制1%瓊脂糖溶液，水浴加溫使充分溶化后，加入培養(yǎng)皿，每皿約加20ml。平置，在室溫下凝固冷卻后，將瓊脂板放在預(yù)先畫好的7孔形圖案上，用打孔器按圖形位置準(zhǔn)確打孔，中心孔孔徑為4mm，周

26、邊孔孔徑為3mm，孔距3mm。也可用7孔型打孔器打孔。小心挑出孔內(nèi)瓊脂，勿破壞周圍瓊脂，而后倒置放入冷藏冰箱保存3-5天備用。2.2 操作方法 檢測血清抗體.1 用微量移液器分別將各被測血清按順序在周邊孔中每間隔一孔加一樣品。中心孔內(nèi)滴加瓊擴(kuò)抗原。余下的周邊孔內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。各孔均以加滿而不溢出為度。.2 將加樣完畢的瓊脂板加蓋后，平放于帶蓋的濕盒內(nèi)，置37溫箱中，24小時內(nèi)觀察并記錄結(jié)果。 用陽性血清檢測病毒抗原（被檢雞的羽髓侵液）：.1 選拔含羽髓豐滿的翅羽或身體其他部位的大羽數(shù)根（幼雞8根，中、成雞3-5根），剪下羽根部分，并按編號分別收集于相應(yīng)的小試管內(nèi)。.2 向每管內(nèi)滴加23滴蒸

27、餾水（羽髓豐滿時也可不加），然后用玻璃棒擠壓羽根，以適當(dāng)?shù)膲毫D(zhuǎn)動玻璃棒，傾斜試管，并用玻璃棒導(dǎo)流使羽侵液流至管口，另一人用加樣器將其吸出，加入外周孔（被檢樣品加入外周2、3、5、6孔中）。.3 向中心孔滴加標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。.4 向空下的1、4孔內(nèi)滴加已知瓊擴(kuò)抗原。以上均已加滿不溢為度。.52.3 結(jié)果判定 被檢樣品孔與中心孔之間形成清晰的沉淀線，并與周邊已知抗原或陽性血清孔的沉淀線相互融合者，判為陽性，不出現(xiàn)沉淀線的則判為陰性。 已知抗原與陽性血清孔之間所產(chǎn)生的沉淀線末端彎向為檢測樣品孔內(nèi)側(cè)時，則該被檢樣品判為弱陽性。 有的收檢材料可能會產(chǎn)生兩條以上沉淀線，其中一線與已知抗原-陽性血清的沉淀線

28、融合者仍判為陽性。實驗七玻片凝集試驗以雞白痢為例掌握試驗原理步驟及應(yīng)用實驗?zāi)康模赫莆针u白痢全血平板凝集試驗方法。此法適用于產(chǎn)蛋母雞和一年以上的公雞白痢病的診斷。（二）實驗內(nèi)容與基本要求：全血平板凝集試驗21試驗材料211雞白痢全血平板凝集反應(yīng)抗原：由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)?？乖o置時是白色或微帶黃色液體，瓶底有灰白色沉淀物，振蕩后成均勻混濁的懸浮液。212陰、陽性血清：由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。陽性血清凝集價應(yīng)不低于1：1600。22操作步驟221抗原試驗前充分振蕩，并使溫度達(dá)到20以上時，方準(zhǔn)應(yīng)用。222用滅菌的吸管吸取雞白痢全血平板凝集反應(yīng)抗原一滴（大約0.05毫升

29、），垂直滴在玻璃板上；同時將被檢雞只固定，用針頭刺破雞冠或翅靜脈，擠出血液以滅菌的鉑金耳（直徑約 4-5毫米）沾取血液一滿環(huán)（約0.02毫升），放在抗原上，隨即用鉑金耳攪拌均勻，靜置待判 定。每次試驗時，均需作陰、陽性血清對照。、2.3判定標(biāo)準(zhǔn)抗原和血液混合后，在2分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯的顆粒凝集或塊狀凝集的，為陽性反應(yīng)，記錄符號“+”?？乖脱夯旌虾?，在2分鐘內(nèi)出現(xiàn)凝集或僅呈現(xiàn)均勻一致的微細(xì)顆粒或在邊緣處由于干燥形成有絮狀物等，均判陰性，記錄符號“-”。除上述反應(yīng)外，不易判定為陽性或陰性的，可判定為可疑反應(yīng)，記錄符號“”?？梢烧邞?yīng)重測一次，若為可疑，則判為陰性。在作凝集反應(yīng)時，應(yīng)在20以上室溫中進(jìn)

30、行。操作時所用過的器材，如鉑金耳、采血針、玻璃板等必須經(jīng)消毒后再用。主要器材與藥品器械:玻璃板（潔凈，絕對無油脂）、酒精燈、吸管（1毫升）、鉑金耳、煮沸消毒器、消毒盤以及采血針?biāo)幤?雞白痢全血平板凝集反應(yīng)抗原、雞白痢陰、陽性血清、（NY/SY1762000） 實驗八 間接血凝試驗以牛日本血吸蟲病為例掌握試驗原理步驟及應(yīng)用實驗?zāi)康模赫莆张Ｈ毡狙x病間接血凝試驗和牛日本血吸蟲糞便孵化技術(shù)，此法適用于牛日本血吸蟲病的流行病學(xué)調(diào)查以及診斷、檢疫和監(jiān)測。（二）實驗內(nèi)容與基本要求： 間接血凝試驗2.1操作方法稀釋被檢血清：取V型96孔微量滴定板，用滴管滴4滴生理鹽水于第1孔內(nèi)，用同一滴管加入被檢血清一滴

31、，使血清成5倍稀釋。用帶12號針頭滴管在第2、3孔中各加生理鹽水1滴。用移液器將第1孔中血清混勻后吸25ul至第2孔中，混勻后吸25ul至第3孔中 ，混勻后再吸25ul丟棄，這樣第2、3孔的血清稀釋度分別為1：10和1：20。每份被檢血清按同樣方法稀釋3個孔，再取兩個孔各加25ul生理鹽水作空白對照。加診斷液：用帶12號針頭的滴管將致敏紅細(xì)胞診斷液各1滴分別加入1:10、1:20血清稀釋孔及空白對照孔。振蕩微量板，使診斷液與血清充分混勻，置20-271-2小時，待空白對照孔中紅細(xì)胞全部沉淀于孔底中央呈一圓點(diǎn)時即可判定結(jié)果。2.2結(jié)果判定凝集反應(yīng)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：陰性（-）：紅細(xì)胞不凝集，全部沉積于孔底

32、成一圓點(diǎn)，周緣整齊。弱陽性（+）：紅細(xì)胞大部分沉底中心，周圍有少量疏松的膜樣凝集。陽性（+）：孔底中心有紅細(xì)胞集中小點(diǎn)，周圍有一薄層凝集紅細(xì)胞。強(qiáng)陽性（+）：紅細(xì)胞全部凝集，均勻地分散于孔底，形成一淡紅色薄層似毛玻璃狀，邊緣甚至皺縮或呈圓圈狀。2.3結(jié)果判定1：20血清稀釋孔出現(xiàn)“+”以上凝集，判為陽性。1：20血清稀釋孔出現(xiàn)“-”者，判為陰性。3.糞便孵化技術(shù)3.1試驗材料40孔/平方寸或60孔/平方寸銅篩，260孔/平方寸尼龍篩，沖洗糞便用各種容器。3.2操作方法尼龍篩淘洗孵化法取牛、馬屬動物糞便50-100克；豬、羊、犬糞便各30-40克，分別放入40孔/平方寸或60孔/平方寸銅紗糞篩內(nèi)

33、，置糞篩于盛有清水的搪瓷杯或塑料杯內(nèi)，充分?jǐn)嚢?-3分鐘后將杯內(nèi)沉渣倒入260孔/平方寸的尼龍兜內(nèi)，用清水淘洗或沖洗尼龍兜中之糞渣，直到洗出的水變清為止。再將尼龍兜中之糞渣移入250-300毫升的三角瓶孵化。塑料杯頂管法取牛、馬屬動物糞便50-100克；豬、羊、犬糞便各30-40克，分別置于260孔/平方寸糞篩內(nèi)，在特制的塑料罐中淘洗，取出糞篩，靜置20分鐘進(jìn)行第一次換水，加滿清水，蓋上有10毫米孔徑的杯蓋，另取一口徑為10毫米玻璃試管，裝滿清水倒插于杯蓋上孵化。為了便于觀察，可在燒瓶或頂管上部加塞一團(tuán)脫脂棉花，再加清水進(jìn)行孵化。3.3孵化：溫度以22-26為宜，室溫在20以上時，無需加溫，可直接進(jìn)行孵化。孵化時應(yīng)具有一定的光線。3.4結(jié)果判定樣品孵化后，于第1、3、5小時各觀察一次，豬的晚數(shù)小時（指毛蚴）。每次每個樣品的觀察時間應(yīng)在一分鐘以上。發(fā)現(xiàn)毛蚴即判為陽性，并立即進(jìn)行登記。如有可疑，可用滴管吸出，在顯微鏡下確診。毛蚴往往在距水面4厘米的范圍內(nèi)活動，灰白色、折光強(qiáng)、梭形，多呈與水面平行或斜向