Agilent高效液相色譜儀操作規(guī)程

1、Agilent1100高效液相色譜儀操作規(guī)程操作說明：1.開機(jī)前準(zhǔn)備：1.1儀器設(shè)備： Agilent 1200LC G1322A (在線脫氣機(jī))。 G1311A (四元泵)。 G1329A（標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器）。 G1316A（柱溫箱）。 G1315A（DAD檢測器）。 色譜柱1.2溶劑準(zhǔn)備： 有機(jī)相必須是色譜級純。 水相必須是二次蒸餾水或用二級蒸餾水配置的緩沖鹽溶液、酸堿溶液。 流動相使用前必須過0.45m的微孔濾膜。有機(jī)相和水相微孔濾膜的選擇參考下表。產(chǎn)品類別代表產(chǎn)品品系產(chǎn)品特點(diǎn)纖維素酯類混合纖維素膜（CN-CA）水相成孔性能好，親水性好，材料成本低。可耐稀酸。不適合于酮類、酯類、強(qiáng)酸、強(qiáng)

2、堿類液體過濾。聚酰胺類尼龍6（PA-6）通用具有親水性，較耐堿不耐酸。在酮、酚、醚及高分子醇類不被腐蝕。聚砜類聚砜（PS）通用良好的化學(xué)和熱穩(wěn)定性，耐輻射，機(jī)械強(qiáng)度高。聚偏氟乙烯/聚四氟乙烯膜PDEF/PTFE有機(jī)PDEF耐化學(xué)腐蝕，耐氧化，耐高溫，疏水性（酒精處理后變清水性），PTFE耐酸堿性強(qiáng)。聚烯烴類聚丙烯膜（PP）有機(jī)具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，耐酸堿和各種有機(jī)溶劑。價格便宜，但孔徑分布寬。無機(jī)材料陶瓷、玻璃BP、金屬膜通用耐高溫，耐有機(jī)溶劑、耐生物降解等。2.基本操作步驟: (一)、開機(jī)： 1、打開計算機(jī),進(jìn)入中文Windows XP畫面,并運(yùn)行CAG Bootp Server程序（部分安

3、裝程序不需要運(yùn)行Bootp）。 2、打開 1200 LC 各模塊電源。 3、待各模塊自檢完成后，雙擊“儀器1 聯(lián)機(jī)”圖標(biāo)，化學(xué)工作站自動與1200LC通訊，進(jìn)入的工作站畫面如下所示。 4、從“視圖”菜單中選擇“方法和運(yùn)行控制”畫面, 點(diǎn)擊“視圖”菜單中的“儀器實際值包括了“進(jìn)樣器狀態(tài)”， “四元泵狀態(tài)”，“柱溫箱狀態(tài)”，“DAD狀態(tài)”?！?，“在線光譜顯示當(dāng)前光譜，可以調(diào)整“吸光度范圍”。 （1 至 4000 mAU，步長為 1），缺省值為 2000 mAU?！保盎瘜W(xué)工作站狀態(tài)顯示化學(xué)工作站就緒情況?！保跋到y(tǒng)視圖”,“樣品視圖”，使其命令前有“”標(biāo)志，來調(diào)用所需的界面。 5、把流動相放入溶劑

4、瓶中。 6、打開沖洗閥。 7、點(diǎn)擊“泵”圖標(biāo)，點(diǎn)擊“設(shè)置泵”選項，進(jìn)入泵編輯畫面。 8 、設(shè)流速：5ml/min，點(diǎn)擊“確定”。 9、點(diǎn)擊“泵” 圖標(biāo)，點(diǎn)擊“控制”選項，選中“啟動”“待機(jī)”就是泵馬達(dá)仍處于激活狀態(tài)，再次打開泵時，無需對其進(jìn)行重新初始化。，點(diǎn)擊“確定”方法出錯時，可以選擇“使用當(dāng)前方法”， 用于確保檢測到儀器錯誤時，泵能夠以受控制的方式關(guān)閉。具體操作為：當(dāng)前方法將立即復(fù)制到泵，并保存為“錯誤方法”。檢測到儀器錯誤時，泵將自動執(zhí)行此方法。 ，則系統(tǒng)開始沖洗，直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止,切換通道繼續(xù)沖洗，直到所有要用通道無氣泡為止。 10、點(diǎn)擊“泵” 圖標(biāo)，點(diǎn)擊“控制

5、”選項，選中“關(guān)閉”，點(diǎn)擊“確定”關(guān)泵， 關(guān)閉沖洗閥。 11、點(diǎn)擊“泵”圖標(biāo)，點(diǎn)擊“設(shè)置泵選項”，設(shè)流速：例如1.0ml/min。 12、點(diǎn)擊泵下面的瓶圖標(biāo)，如下圖所示（以單元泵為例），輸入溶劑的實際體積和瓶體積。 也可輸入停泵的體積，點(diǎn)擊“確定”。13、點(diǎn)擊“泵”圖標(biāo)，點(diǎn)擊“泵輔助設(shè)定”，設(shè)定“最流速梯度您可以為溶劑流量的變化速率設(shè)定一個限制，以保護(hù)您的分析柱。限值：0.1 至 100 ml/min/min。缺省值為 100 ml/min/min?！?，“最小沖程此參數(shù)定義活塞 1 的一個沖程轉(zhuǎn)移的流動相的體積。泵的沖程體積影響混合性能和梯度線性。當(dāng)沖程被設(shè)置為“自動”（缺省值）時，泵將根據(jù)設(shè)

6、定的流速選擇沖程體積。在流速最大為 100 l/min 時泵使用 20 l 沖程，在流速為 5ml/min 時沖程以線性方式增加到 100 l。流速在 5ml/min 和 10ml/min 之間時，沖程始終為 100 l。您可以將最小沖程設(shè)置為介于 20 和 100 l 之間的值。如果您選擇的最小沖程小于以“自動”模式運(yùn)行的泵將使用的最小沖程，泵將使用較大的沖程體積?！保皦嚎s因子流動相的壓縮因子可以影響泵的性能。要獲得最佳的流量準(zhǔn)確度和混合性能，您可以根據(jù)所使用的流動相來設(shè)置該參數(shù)。壓縮因子的缺省值為 100 * 10-6。如果四元泵混合了壓縮因子差別很大的溶劑（例如水和甲醇），則建議您使用

7、此缺省值。 限值：0 到 150?！?，“主通道”。（二）、數(shù)據(jù)采集方法編輯：1、開始編輯完整方法： 從“方法”菜單中選擇“編輯完整方法” 項，如下圖所示選中除“數(shù)據(jù)分析 ”外的三項，點(diǎn)擊“確定”，進(jìn)入下一畫面。2、方法信息： 在“方法注釋”中加入方法的信息（如：測試方法）。 點(diǎn)擊 “確定”， 進(jìn)入下一畫面。3、泵參數(shù)設(shè)定：（以四元泵為例） 在“流速”處輸入流量,如1ml/min，在“溶劑 B”處輸入80.0,(A=100-B-C-D) ,也可“插入”一行“時間表” ,編輯梯度。在“壓力限”處輸入柱子的最大耐高壓，以保護(hù)柱子。 點(diǎn)擊“確定”，進(jìn)入下一畫面。4、自動進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)定:（以標(biāo)準(zhǔn)G132

8、9A為例） 選擇合適的進(jìn)樣方式, 如圖所示，進(jìn)樣體積 5.0ul ,洗瓶位置為6號?！皹?biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣”-只能輸入進(jìn)樣體積，此方式無洗針功能?！跋瘁樳M(jìn)樣”-可以輸入進(jìn)樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽完樣品后，會在洗瓶中洗針?！笆褂眠M(jìn)樣器程序”-可以點(diǎn)擊“編輯”抽?。菏棺詣舆M(jìn)樣器能夠從指定源抽取樣品。排出：移動到指定位置，并從針中排出指定的量。混合：通過前后移動進(jìn)樣器活塞從而在空氣或針座中混合抽取量。混合：通過將針移至針座、將閥從旁路切換至主路并生成開始脈沖來完成進(jìn)樣。靜置：自動進(jìn)樣器等待的指定時間（0 至 99999 分鐘） 按鈕進(jìn)行進(jìn)樣程序編輯?！白顑?yōu)化”有“無將不優(yōu)化。”，“重疊進(jìn)樣周期將在檢

9、測過程中將下一針樣品抽取到進(jìn)樣器中等待，并可以設(shè)置等待時間，以節(jié)約檢測時間，但具有較大風(fēng)險性，具體見說明”和“預(yù)取進(jìn)樣瓶將在檢測過程中將下一針樣品放置于針旁邊等待，并可以設(shè)置等待時間，以節(jié)約檢測時間，具體見說明”，可以根據(jù)實際情況選擇。 點(diǎn)擊進(jìn)“確定”，進(jìn)入下一畫面。5、柱溫箱參數(shù)設(shè)定: 在“溫度”下面的空白方框內(nèi)輸入所需溫度,如：40度。并選中它,點(diǎn)擊“更多>>” 鍵,如圖所示,選中“與左側(cè)相同”，使柱溫箱的溫度左右一致。 點(diǎn)擊“確定”，進(jìn)入下一畫面。6、檢測器參數(shù)設(shè)定:6.1、VWD檢測器 在“波長”下方的空白處輸入所需的檢測波長,如254nm, 在“峰寬 (響應(yīng)時間)”下方點(diǎn)

10、擊下拉式箭頭,選擇合適的響應(yīng)時間, 如>0.1min(2s)。 在“時間表” 中可以“插入”一行，輸入隨時間切換的波長，如1min，波長=300nm。點(diǎn)擊“確定”，進(jìn)入下一畫面。6.2、DWD檢測器7、在“ 運(yùn)行時選項表 ”中選中“ 數(shù)據(jù)采集“將方法和數(shù)據(jù)保存在一起”提供了一種可以在以后重構(gòu)分析的方法，即使在這期間方法已更改。您可以看到方法中或選定參數(shù)中的更改對分析產(chǎn)生的影響，有助于對方法進(jìn)行優(yōu)化。如果您希望化學(xué)工作站使用標(biāo)準(zhǔn)宏 RunDAMethod 分析從運(yùn)行中收集的數(shù)據(jù)，請選擇“標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析”。如果您希望化學(xué)工作站根據(jù)其他宏而不是標(biāo)準(zhǔn)宏 (RunDAMethod) 分析所收集的數(shù)據(jù)

11、，請選擇“自定義數(shù)據(jù)分析宏”。并在相應(yīng)的文本框中輸入您準(zhǔn)備好的宏名稱?！保c(diǎn)擊“確定”。8、點(diǎn)擊“方法”菜單，選中“方法另存為”，輸入一方法名，如“測試”，點(diǎn)擊“確定”。9、從菜單 “視圖”中選中“在線信號”,選中“信號窗口1”,然后點(diǎn)擊“改變” 鈕,將所要繪圖的信號移到右邊的框中,點(diǎn)擊“確定”。(如同時檢測二個信號,則重復(fù)此操作,選中“信號窗口2”。單擊“改變”鍵，即可彈出右側(cè)的“編輯信號圖譜”窗口，進(jìn)而選擇所需的譜圖信號。10、點(diǎn)擊“確定” ,從“儀器” 菜單選擇“系統(tǒng)開啟”。（三）、序列的設(shè)置1、從“序列”菜單中，打開“序列表”，光標(biāo)至于“行1”，單擊“剪切”，去除“行1”，再單擊“插入

12、/批量輸入向?qū)А薄?、設(shè)置“操作”為“追加”，“開始位置”為“1”，“插入行數(shù)”為所需的樣品數(shù)，如“3”，“方法名稱”為“測試”，“樣品名稱”為“排毒清脂片”，“進(jìn)樣次數(shù)”為“3”，“樣品類型”為“樣品”或“標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”“質(zhì)控物質(zhì)”，點(diǎn)擊“確定”：3、光標(biāo)至于“行3”、單擊“追加一行”，設(shè)置沖洗儀器和色譜柱的樣品和方法，“方法名稱”選擇已經(jīng)設(shè)置好的“水醇洗柱”。4、單擊“確定”，完成序列設(shè)置。5、從“序列”菜單中，打開“序列參數(shù)”選項，如下圖所示，輸入操作者名稱，如“安裝工程師”；在“數(shù)據(jù)文件 ”中選擇“手動”或“前綴/計數(shù)器”區(qū)別:手動-每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會將上次的數(shù)據(jù)覆蓋掉

13、。 在前綴/計數(shù)器-“前綴”框中輸入前綴，在“計數(shù)器”框中輸入計數(shù)器的起始位，儀器會自動命名，如vwd數(shù)據(jù)0001，vwd數(shù)據(jù)0002。，單擊“確定”，完成設(shè)置。6、從“序列”菜單中，打開“保存序列”選項，輸入“文件名”，如“測試”， 單擊“確定”，完成設(shè)置。7、等儀器準(zhǔn)備好，基線平穩(wěn)，從“運(yùn)行控制”菜單中選擇“運(yùn)行序列”，進(jìn)樣（或者從操作界面上點(diǎn)擊“開始”，進(jìn)樣）。(若無自動進(jìn)樣器，則基線平穩(wěn)后，進(jìn)樣并搬動手動進(jìn)樣閥，啟動運(yùn)行。)（DAD, VWD色譜圖如下所示：）（四）、數(shù)據(jù)分析方法編輯:1、從“視圖”菜單中，點(diǎn)擊“數(shù)據(jù)分析在線檢驗的時候是不能打開聯(lián)機(jī)分析的，只能重新打開脫機(jī)分析，軟件會自

14、動提醒打開。”進(jìn)入數(shù)據(jù)分析畫面。2、從“文件”菜單選擇“調(diào)用信號”，選中您的數(shù)據(jù)文件名，如下圖所示。點(diǎn)擊“ 確定”，則數(shù)據(jù)被調(diào)出。3、做譜圖優(yōu)化：從“圖形”菜單中選擇“信號選項”，如下圖所示。從“范圍”中選擇“滿量程” 或“自動量程” 及合適的時間范圍或選擇“自定義量程”調(diào)整。反復(fù)進(jìn)行，直到圖的比例合適為止。點(diǎn)擊“確定”。4、積分: 從“積分”菜單中選擇“積分事件”選項，如下圖所示。選擇合適的“斜率靈敏度”，“峰寬”，“最小峰面積”，“最小峰高”。 從“積分”菜單中選擇“積分”選項， 則數(shù)據(jù)被積分。 如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)經(jīng)典：接受基線滲透。無滲透：通過重新建立基線來消除基線滲

15、透。高級：積分器嘗試優(yōu)化峰的開始位置和結(jié)束位置、重新建立峰束基線并消除基線滲透。，直到滿意為止。 點(diǎn)擊左邊“”圖標(biāo)，將積分參數(shù)存入方法該方法必須是獨(dú)立的與本檢驗相關(guān)的方法，不能是其他產(chǎn)品的方法，比如“丹參含測”分析方法不能保存為“人參檢驗”。5、打印報告: 從“報告”菜單中選擇“設(shè)定報告”選項，進(jìn)入如下圖所示畫面。 點(diǎn)擊“定量結(jié)果”框中“計算”右側(cè)的黑三角，選中“面積百分比”，其它選項不變。 點(diǎn)擊“ 確定”。 從“報告”菜單中選擇“打印報告”，則報告結(jié)果將打印到屏幕上，如想輸出到打印機(jī)上，則點(diǎn)擊“報告” 底部的“打印”鈕。(四)、關(guān)機(jī): 關(guān)機(jī)前，先關(guān)燈，并必須用相應(yīng)的溶劑充分沖洗系統(tǒng)。 退出化

16、學(xué)工作站，依提示關(guān)泵，及其它窗口，關(guān)閉計算機(jī)。 關(guān)閉Agilent 1200各模塊電源開關(guān)。(五)、Agilent 1200 LC維護(hù)保養(yǎng)：1、色譜柱長時間不用，存放時，柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑，兩端封死（如乙腈/甲醇適于反相色譜柱，正相色譜柱用相應(yīng)的有機(jī)相）。2、手動進(jìn)樣器，當(dāng)使用緩沖溶液時，要用水沖洗進(jìn)樣口。3、流動相使用前必須過濾，不要使用多日存放的蒸餾水（易長菌）。4、帶seal-wash的 1200，要配制90%水+10%異丙醇，開啟seal-wash清洗泵，溶劑不能干涸。5、注意事項見說明書，或由現(xiàn)場工程師介紹。(六)、維護(hù)知識問答1、 為什么溶劑和樣品要過濾? 溶劑和樣品過濾非常重要，它會

17、對色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對分析結(jié)果的影響。色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。2、 為什么HPLC用緩沖鹽時要加在線Seal-wash選項？ HPLC用緩沖鹽時,由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象,析出的細(xì)小鹽粒非常堅硬,它附著在藍(lán)寶石活塞桿上,隨著藍(lán)寶石活塞桿的往復(fù)運(yùn)動,容易產(chǎn)生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線Seal-wash選項能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。緩沖鹽的濃度在0.1mol或大于0.1mo

18、l時,必須使用該在線沖洗選項.清洗液配制: 90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長和減小水的表面張力，不能干涸。3、 為什么Agilent 1200LC的流動相管路非常細(xì)? 在使用HPLC時,應(yīng)特別注意”柱外效應(yīng)”對分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動相中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體中小45個數(shù)量級，液體流動相的流速也比氣相慢12個數(shù)量級。因此，樣品進(jìn)入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管、檢測器）中，樣品分子的擴(kuò)散和滯留，都會引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之最小，獲得理想的分析結(jié)果，Agilent 1200LC 使用加工工藝難度高的毛細(xì)管線作為流動相管路。

19、毛細(xì)管線分類：0.17mm內(nèi)徑 -綠色 ;0.12mm內(nèi)徑-紅色。 PEEK 管線：內(nèi)徑 -0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。毛細(xì)管線優(yōu)點(diǎn): 柔韌性好. *Agilent 公司同時備有1/16in 的粗外徑毛細(xì)管線,適用于不同習(xí)慣的用戶 ,優(yōu)點(diǎn)是剛性好,但柔韌性差一些。 4、 流動相使用前為什么要脫氣？ 流動相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD

20、，可能會造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10- 15min，此法效果最差。在線真空脫氣法：Agilent1200LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)，在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。5、如何防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？ 溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長會堵塞溶劑過濾器，從而影響泵的運(yùn)行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=

21、47）。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞。A：請嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過濾。B：請勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液C：如果應(yīng)用許可，可在溶劑中加入0.0001-0.001M的疊氮化鈉. D:在溶劑瓶內(nèi)溶劑的上方小流量連續(xù)吹氬氣,以隔絕空氣。E：避免使溶劑瓶暴露在直射陽光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。6、 Agilent 1200LC泵如何維護(hù)？Agilent 1200LC泵給色譜柱提供穩(wěn)定、無脈動、流量準(zhǔn)確的流動相，及時合理的維護(hù)非常重要。A：流動相使用前請必須脫氣、過濾。B：使用緩沖鹽時，要加在線Seal-wash選項。C：關(guān)機(jī)前，用相應(yīng)的溶劑充分沖洗系統(tǒng)。 D：及時更換Purge Valve內(nèi)的過濾芯。（當(dāng)打開Purge Valve時，壓力高于10bar，表明過濾芯已堵）。 E：使用合適的密封圈。7、 如何選擇合適的泵頭活塞密封圈？ 泵頭活塞的標(biāo)準(zhǔn)密封圈能適合于大多數(shù)應(yīng)用，但使用正相溶劑（如正己烷），不適合使用標(biāo)準(zhǔn)活塞密封圈，特別是長時間使