實驗三、葉綠素含量的測定等課件

1、實驗三、葉綠素含量的測定等實驗三、實驗三、葉綠體色素含量的測定（分光光度法葉綠體色素含量的測定（分光光度法 和和SPADSPAD葉綠素儀法葉綠素儀法 ） 高等植物在光合反應中吸收光能的主要色素為葉綠素 ,其含 有的葉綠素 a和葉綠素 b能將光能轉(zhuǎn)化為化學能 ,形成有機物質(zhì)。因此 ,葉片中葉綠素含量的高低是反映植物葉片光合能力的一個重要指標。一、目的: 了解分光光度計和SPAD葉綠素儀的使用方法；理解分光光度計測定葉綠體色素含量的實驗原理；掌握計算葉綠體各色素成分含量的方法。實驗三、葉綠素含量的測定等要求： 2、問答題： （1 ）Lambert-Beer定律又叫什么定律？列出其數(shù)學表定律又叫什么

2、定律？列出其數(shù)學表達式（并說明各符號的代表意義）。達式（并說明各符號的代表意義）。 Lambert-Beer 定律中的比例系數(shù)定律中的比例系數(shù)“K ”的物理意義是的物理意義是 ？ Lambert-Beer 定律本身是否有局限性？何謂吸光度的加和性？定律本身是否有局限性？何謂吸光度的加和性？ （2 ）葉綠素在蘭光區(qū)的吸收峰高于紅光區(qū)的吸收峰）葉綠素在蘭光區(qū)的吸收峰高于紅光區(qū)的吸收峰,為何為何不用蘭光區(qū)的光吸收來測定葉綠素的含量？不用蘭光區(qū)的光吸收來測定葉綠素的含量？ （3）本實驗為什么要用光路寬度為）本實驗為什么要用光路寬度為1cm的比色杯？的比色杯？實驗三、葉綠素含量的測定等二、原理 葉綠素提

3、取液中同時含有葉綠素葉綠素提取液中同時含有葉綠素a a和葉綠素和葉綠素b,b,二者的吸收光譜雖有不同二者的吸收光譜雖有不同, ,但又存在著明顯的重疊但又存在著明顯的重疊（如圖）（如圖）, ,在不在不分離葉綠素分離葉綠素a a和葉綠素和葉綠素b b的情況下同時測的情況下同時測定葉綠素定葉綠素a a和葉綠素和葉綠素b b的濃度的濃度, ,可分別測可分別測定在定在665nm665nm和和649nm649nm的光吸收的光吸收, , 由于在由于在該波長時葉綠素該波長時葉綠素a a、b b的比吸收系數(shù)的比吸收系數(shù)K K為為已知，我們即可以根據(jù)已知，我們即可以根據(jù)Lambert-BeerLambert-Be

4、er定律定律, ,列出濃度列出濃度C C與光密度與光密度D D之間的關(guān)系之間的關(guān)系式：式： D D665665=83.31Ca+18.60Cb.(1)=83.31Ca+18.60Cb.(1) D D649649=24.54Ca+44.24Cb.(2)=24.54Ca+44.24Cb.(2) 從而計算出提取液中葉綠素從而計算出提取液中葉綠素a a和葉綠素和葉綠素b b的濃度的濃度. . 葉綠素a、b的比吸收系數(shù)波長波長(nm)葉綠素葉綠素a葉綠素葉綠素b66583.3118.60649 24.5444.24注：注：(1)(2)式中的式中的D665、D649為葉綠素溶液在波長為葉綠素溶液在波長66

5、5nm和和649nm時時的光密度。葉綠素的光密度。葉綠素a、b的濃度單位為：的濃度單位為：g/L 實驗三、葉綠素含量的測定等 解方程式解方程式(1)(2)(1)(2)，則得：，則得：Ca=13.7 DCa=13.7 D6656655.76D5.76D649649 (3) (3)Cb=25.8 DCb=25.8 D6496497.6 D7.6 D665665.(4).(4)G G總總=Ca+Cb=6.10D=Ca+Cb=6.10D665665+20.04D+20.04D649649(5)(5)注：此時，此時，Ca、Cb為葉綠素為葉綠素a、b濃度，單位為濃度，單位為:mg/L，利用上面（，利用上面

6、（3）（）（4）(5)式，即可以計算葉綠素式，即可以計算葉綠素a、b含量及總?cè)~綠素的總含量含量及總?cè)~綠素的總含量(G總)。 實驗三、葉綠素含量的測定等二、材料：大紅花老葉和嫩葉 三、實驗步驟1. 1. 取新鮮大紅花葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈取新鮮大紅花葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。 2. 2. 稱取剪碎的新鮮樣品稱取剪碎的新鮮樣品0.5g0.5g，放入研缽中，加少量碳酸鈣，放入研缽中，加少量碳酸鈣和石英砂及和石英砂及2 23ml953ml95乙醇，研成均漿，再加乙醇乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml10m

7、l，暗，暗處靜置處靜置3 35min5min。3. 3. 取濾紙取濾紙1 1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到入漏斗中，過濾到25ml25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。研棒及殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。4. 4. 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25ml25ml，搖勻。，搖

8、勻。5. 5. 把葉綠體色素提取液把葉綠體色素提取液稀釋稀釋5 5倍倍后倒入后倒入光徑光徑1cm1cm的比色杯內(nèi)。的比色杯內(nèi)。以以9595乙醇為參比，在波長乙醇為參比，在波長665nm665nm、649nm649nm下測定光密度。下測定光密度。實驗三、葉綠素含量的測定等四、實驗結(jié)果計算四、實驗結(jié)果計算 將測定得到的吸光值代入下面的式子：將測定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.7 D6655.76D649 (3)Cb=25.8 D6497.6 D665.(4)G總=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649(5) 分別計算葉綠素分別計算葉綠素a a、b b和總?cè)~綠素的含量和總?cè)~綠素的

9、含量ChlChl（mg/g.FWmg/g.FW）= =樣品鮮重稀釋倍數(shù)提取液體積葉綠素的濃度1000實驗三、葉綠素含量的測定等開機調(diào)零測量1測量2測量3求平均值實驗三、葉綠素含量的測定等一一 分光光度計的工作原理：分光光度計的工作原理： 分光光度計采用一個可以產(chǎn)生分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波多個波長長的的光源光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長特定波長的的光源光源，光源透過測試的樣品后，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的樣品的吸光值吸光值與與樣樣品的濃度

10、品的濃度成成正比正比。實驗三、葉綠素含量的測定等二二 分光光度計的基本常識：分光光度計的基本常識： 1 1、紫外光分光光度計，其使用、紫外光分光光度計，其使用波長在波長在190190400nm,400nm,可見光分光光度計，其使用可見光分光光度計，其使用波長在波長在400400800nm800nm。 2 2 消光系數(shù)：消光系數(shù)：是溶液對光吸收的比例常數(shù)，指在一定的是溶液對光吸收的比例常數(shù)，指在一定的濃度和波長等條件下物質(zhì)的光吸收值，用濃度和波長等條件下物質(zhì)的光吸收值，用K K表示。它取表示。它取決于溶質(zhì)性質(zhì)、入射光波長和溫度。決于溶質(zhì)性質(zhì)、入射光波長和溫度。 消光度消光度（也叫光密度（也叫光密

11、度ODOD，或吸光值，或吸光值A A）：表示溶液吸收）：表示溶液吸收光的強弱或吸收程度，也用光的強弱或吸收程度，也用E E表示。表示。E E值愈大，溶液對光值愈大，溶液對光吸收的程度愈大。吸收的程度愈大。 透光率（透光率（用用T表示）表示） ：是透射光強度（透過比色皿）是透射光強度（透過比色皿）與入射射光強度（還未過比色皿之前的光強度）之比與入射射光強度（還未過比色皿之前的光強度）之比（用（用T =It /I0表示）表示） 。實驗三、葉綠素含量的測定等三、三、 分光光度計的基本維護及使用注意事項：分光光度計的基本維護及使用注意事項： 1 1 分光光度計必須放置在固定且不受震動的儀器臺上，不分光

12、光度計必須放置在固定且不受震動的儀器臺上，不能隨意搬動。嚴防震動、潮濕和強光直射。能隨意搬動。嚴防震動、潮濕和強光直射。 2 2 分光光度計內(nèi)放有硅膠干燥袋應定期更換。分光光度計內(nèi)放有硅膠干燥袋應定期更換。 3 3 儀器連續(xù)使用時間不應超過儀器連續(xù)使用時間不應超過2 2小時，小時，每次使用需歇半小每次使用需歇半小時以上才能再用。用完儀器后，務必關(guān)避電源開關(guān)，拔下時以上才能再用。用完儀器后，務必關(guān)避電源開關(guān)，拔下插頭。清理儀器上的雜物（包括灰塵、水嘖、溶液等）。插頭。清理儀器上的雜物（包括灰塵、水嘖、溶液等）。 4 4 千萬不可用手、濾紙、毛刷等物摩擦千萬不可用手、濾紙、毛刷等物摩擦比色杯的光滑

13、面比色杯的光滑面。不允許用酒精、汽油、乙醚等有機溶液擦洗儀器。不允許用酒精、汽油、乙醚等有機溶液擦洗儀器。 5 5 盛待液時，必須達到比色杯的盛待液時，必須達到比色杯的2/32/3左右，不宜過多。用左右，不宜過多。用完比色杯后應立即用自來水沖洗，再用蒸餾水洗凈。完比色杯后應立即用自來水沖洗，再用蒸餾水洗凈。 6 6 每套分光光度計上的比色杯及比色槽不得隨意更換。每套分光光度計上的比色杯及比色槽不得隨意更換。 7 7 測定某未知待測液時，先制作該溶液的吸收光譜曲線，測定某未知待測液時，先制作該溶液的吸收光譜曲線，再選擇再選擇最大峰的波長作為測定的波長最大峰的波長作為測定的波長。一般所制成的溶液。

14、一般所制成的溶液應應盡量使光密值在盡量使光密值在0.10.10.70.7的范圍內(nèi)的范圍內(nèi)測定。測定。實驗三、葉綠素含量的測定等VIS-723N可見分光光度計 比色皿校正和多波長測定比色皿校正和多波長測定 操作步驟：1.在主菜單下選擇“2光度測量”主菜單1波長掃描2光度測量3定量分析4時間掃描5實時測量6系統(tǒng)設置3.比色皿配對完成后，按比色皿配對完成后，按“RETURN”鍵退鍵退回光度測量參數(shù)設置界面?；毓舛葴y量參數(shù)設置界面。4.按按F2開始測量?？砂凑掌聊簧系奶崾具M行開始測量?？砂凑掌聊簧系奶崾具M行測量操作，當有多個樣品需要測量時，可測測量操作，當有多個樣品需要測量時，可測完一個后再按完一個后

15、再按“F2”測下一個。注意樣品的測下一個。注意樣品的編號編號N值必須和比色皿的編號一致。值必須和比色皿的編號一致。2.按按“F1”進行比色皿的校正，輸入進行比色皿的校正，輸入除參比杯外的比色杯個數(shù)后按除參比杯外的比色杯個數(shù)后按“ENTER”鍵，再按鍵，再按“F2”，根據(jù)儀，根據(jù)儀器提示進行操作即可。器提示進行操作即可。實驗三、葉綠素含量的測定等AM-300手持式葉面積儀測定葉面積手持式葉面積儀測定葉面積原理：原理：內(nèi)置固體標準光源的CCD掃描系統(tǒng) 開機,按住電源開關(guān)1秒 選擇顯示方向 放入材料（不能直接接觸探頭） 按住探頭上紅色button,直至發(fā)出兩種連續(xù)蜂鳴,屏幕提示“measure”可開始測量 探頭從材料上方勻速滑過，等屏幕顯示出完整葉片形狀后再次按紅色button結(jié)束測量 實驗三、葉綠素含量的測定等 植物葉面積的測定（畫紙稱重法）植物葉面積的測定（畫紙稱重法） 將所測葉片放在厚度均勻的稱量紙上，用鉛筆將葉形畫好，剪下所畫的紙葉，在電子天平上稱重，記為W1；另取10*10cm2的紙片，稱重記為W2；則所測葉片面積X可按下面公式計算出。 X（cm2）W1/W2100實驗三、葉綠素含量的測定等CB-1102便攜式光合蒸騰測定儀實驗三、葉綠素含量的測定等特點： 非破壞性測量，即不離體測量 具有開路和閉路測量兩種光合測量方式 可以手動或自動測量，可