永生化胚胎肝細胞系的構建及其生物學特性

1、永生化胚胎肝細胞系的構建及其生物學特性        作者：李羽，白雪帆，王軍，徐哲，張巖【要害詞】 永生化；肝細胞；細胞系；生物學特性；SV40；脂質(zhì)體Establishment and biological characterization of an immortalized human fetal hepatocyte line【Abstract】 AIM: To establish an immortalized human fetal hepatocyte line and to study its b

2、iological characteristics and functions. METHODS: Human fetal hepatocytes were transfected with pcDNA3.1 recombined vector containing the Simian Virus 40 large T antigen. Characteristics of the immortalized fetal hepatocyte line were evaluated by morphologic and functional detection. RESULTS: One of

3、 the hepatocyte clones displaying highly differentiated in liver function and immortalized characteristics had been screened after 40 day selection of 700-300 mg/L G418. The immortalized hepatocyte line maintained the most morphologic characteristics of primary hepatocyte. The cell cloneforming rat

4、was 31.2%. The immortalized human fetal hepatocytes had a normal karyotype and were not able to grow in soft agar culture. It had the ability of composing albumin and the immunohistochemical test showed that the SV40T gene had been integrated into the transformed cell genome. CONCLUSION: The immorta

5、lized human fetal hepatocyte line has the similar most morphologic characteristics and biological function to primary hepatocytes, and it would become ideal cell material on the study of bioartificial liver and hepatocyte transplantation.【Keywords】 immortalized; hepatocytes; cell line; characterizat

6、ion; SV40; liposomes【摘要】 目的: 構建永生化肝細胞系并對其生物學特性及某些功能進行研究. 方法： 利用SV40T基因和真核表達載體pcDNA3.1經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至體外分離培養(yǎng)的人胚胎肝細胞，使其永生化，進一步鑒定其形態(tài)學特征和生物學功能. 結果： 經(jīng)G418 700300 mg/L篩選，40 d后獲得一株陽性克隆. 形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，該細胞具有原代培養(yǎng)肝細胞的大多數(shù)典型特征. 永生化胚胎肝細胞克隆形成率為31.2%，染色體核型分析表明細胞核型無明顯異常，軟瓊脂集落形成試驗表明細胞在軟瓊脂中不能生長，免疫組化證實SV40T基因已整合入細胞，而且該細胞具有合成白蛋白的功能. 結

7、論： 新建胚胎肝細胞系具有與原代肝細胞類似的形態(tài)特征及生物學功能，可以成為生物人工肝及肝細胞移植研究中的理想細胞材料.【要害詞】 永生化；肝細胞；細胞系；生物學特性；SV40；脂質(zhì)體【中圖號】 R512.60引言原位肝移植可以有效治療各種原因引起的肝功能衰竭，因而成為治療肝功能衰竭的唯一有效手段. 但由于受到技術復雜、價格昂貴尤其是供肝短缺的困擾，使它的臨床應用受到很大限制，難以及時有效地拯救患者的生命. 研究顯示生物人工肝及肝細胞移植可以作為一種有效的替代治療手段，幫助患者渡過危險期等待肝移植甚至直接取得令人滿足的療效，因而為肝衰竭的治療提供了一種新的選擇1-5. 而該項技術的應用需要足夠數(shù)

8、量肝細胞材料，動物肝細胞或者各種肝細胞系由于存在病毒感染及潛在的致瘤危險，無法成為理想的選擇. 從理論上講人源性肝細胞應該是最佳材料，但原代細胞體外培養(yǎng)增殖及傳代困難，而且來源同樣受到很大限制，為此我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，構建了一株永生化胚胎肝細胞系，并對其生物學特性進行研究，希望可以為生物人工肝及肝細胞移植的臨床開展提供理想而充足的細胞材料.1材料和方法1.1材料含有SV40 Large T抗原片段的質(zhì)粒pcD2由北京大學人民醫(yī)院婦科腫瘤中心劉廣芝教授惠贈，真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1由本校微生物教研室保存. 1428 wk水囊引產(chǎn)死胎由本院婦產(chǎn)科提供，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibc

9、o公司；DMSO及秋水仙素為Sigma公司產(chǎn)品；抗SV40T單克隆抗體購自USBio公司；人血白蛋白單克隆抗體購自DAKO公司，質(zhì)粒提    取試劑盒為Promega產(chǎn)品.1.2方法1.2.1重組質(zhì)粒的構建及鑒定提取含SV40LargeT的pcD2質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶BamH單酶切，10 g/L瓊脂糖電泳. 回收含目的DNA片段的凝膠，純化后用T4 DNA連接酶與pcDNA3.1空載體進行連接. 制備感受態(tài)細胞并提取重組質(zhì)粒. 用限制性內(nèi)切酶BamH進行酶切，10 g/L瓊脂糖電泳鑒定.1.2.2胚胎肝細胞的分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染取引產(chǎn)死胎兒置無菌托盤中，常規(guī)消毒

10、鋪單后打開腹腔，顯露游離門靜脈后插管，用DHanks液（含0.01 g/L EDTA，37，pH 7.4，通以含950 mL/L O2及50 mL/L CO2的混和氣體）以20 mL/min的速度灌入，隨后于下腔靜脈插管放出積血積液，并剪開胸腔，夾閉上腔靜脈. 灌注5 min至肝臟變色后改為含0.05 g/L膠原酶的Hanks液（37，pH 7.4，通以含950 mL/L O2，50 mL/L CO2的混合氣體）持續(xù)灌注5 min. 取下肝臟，置于含4 Hanks液的平皿中，剪開肝被膜，疏下肝細胞，以單層無菌紗布過濾，制成混合細胞懸液，以100目及200目篩網(wǎng)過濾，500 r/min清洗離心次

11、，每次2 min，棄上清，以4 Hanks液重懸，臺盼藍（Trypan Blue）染色判定細胞活率，肝細胞活率>90時，計數(shù)制成肝細胞懸液，以終濃度1×105/mL接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，選擇低糖DMEM培養(yǎng)基，其中含15 mL/L胎牛血清、10 nmol/L胰島素，培養(yǎng)48 h后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒SV40T/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至胎肝細胞. 用含700 mg/L G418的培養(yǎng)液篩選1 wk，將G418濃度改為300 mg/L，至出現(xiàn)陽性克隆，將其轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶進行擴大、傳代培養(yǎng).1.2.3細胞形態(tài)的觀察在倒置顯微鏡下觀察新建肝細胞系的形態(tài)，并在電子顯微鏡下觀察細胞的超微結構

12、.1.2.4細胞生長曲線的測定細胞消化后制成懸液，以103濃度接種于96孔板內(nèi)，37，50 mL/L CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，天天取8孔加入MTT溶液20 L/孔, 37繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)吸去上清，加入150 L DMSO，振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm波長，測定光吸收值取平均值，連續(xù)測定12 d. 以時間為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制細胞生長曲線.1.2.5細胞克隆形成率肝細胞以1個細胞/孔的密度接種于96孔板，連續(xù)培養(yǎng)15 d，在倒置顯微鏡下觀察含有50個以上細胞的細胞克隆數(shù)，按下列公式計算細胞克隆形成率：克隆形成率（%）（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%.&

13、#160;   2007-12-06        1.2.6軟瓊脂試驗肝細胞預先制成細胞懸液，在60 mm培養(yǎng)皿中預先鋪上含12 g/L瓊脂的培養(yǎng)基，將細胞以1×105/皿濃度與37預溫的含6 g/L瓊脂的培養(yǎng)基混勻后，接種于平皿內(nèi)底層瓊脂培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)20 d后觀察克隆形成數(shù).1.2.7染色體檢查取對數(shù)生長期的肝細胞加入終濃度為0.5 mg/L的秋水仙堿，繼續(xù)作用4 h，收集分裂中期細胞，離心去上清，加入0.075 mol KCl低滲處理20 min，最后經(jīng)甲醇冰乙酸

14、固定，制片，Giemsa染色后，在油鏡下觀察染色體形態(tài).1.2.8免疫組織化學方法檢測整合的SV40T基因及ALB在細胞中的表達新建胎肝細胞系常規(guī)爬片，PBS清洗，4丙酮固定，30 mL/L H2O2處理，血清封閉，分別滴加人血清白蛋白單克隆抗體及SV40T單克隆抗體，孵育60 min，然后滴加HRP標記的二抗，孵育60 min，蘇木精復染. 脫水、透明、封片、鏡檢.2結果2.1重組質(zhì)粒的鑒定重新構建的質(zhì)粒SV40T/pcDNA3.1經(jīng)BamH單酶切，酶切產(chǎn)物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，獲得大小約2600 bp及5600 bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段大?。▓D1）.圖1

15、重組質(zhì)粒酶切鑒定（略）2.2胚胎肝細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染原代胚胎肝細胞經(jīng)分離純化，細胞存活率達91%. 體外培養(yǎng)48 h后，可見80%貼壁，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SV40T/pcDNA3.1重組質(zhì)粒，G418篩選40 d后出現(xiàn)一簇抗G418的陽性克隆. 將其轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng).2.3細胞形態(tài)觀察胚胎肝細胞在培養(yǎng)瓶中呈單層貼壁生長，細胞呈橢圓形、典型的上皮細胞樣特征，傳代一次約需5 d時間（圖2A）. 透射電鏡觀察，細胞呈典型的肝細胞形態(tài)與結構，細胞核仁增大，胞內(nèi)含豐富的糖原顆粒，細胞極性恢復可見緊密連接和毛細膽管重建（圖2B）.圖2胚胎肝細胞形態(tài)結構（略）2.4細胞生長曲線根據(jù)MTT數(shù)據(jù)繪制的生長曲線顯

16、示，細胞在培養(yǎng)第4日進入對數(shù)生長期，第7日進入平臺期，第12日后開始出現(xiàn)凋亡（圖3）.圖3胚胎肝細胞生長曲線（略）2.5細胞克隆形成率及軟瓊脂集落形成試驗細胞連續(xù)培養(yǎng)15 d，形成非常明顯的克隆，克隆形成率為31.2%. 而在軟瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，細胞連續(xù)生長20 d，未見有細胞克隆形成，說明該永生化肝細胞不能在軟瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)生長.2.6染色體核型分析第16，28，45代肝細胞各計數(shù)30個分裂相，均為正常二倍體細胞，染色體為23對，核型結構與正常人肝細胞相同（圖4）.圖4染色體核型分析（略）2.7免疫組織化學檢測結果以抗SV40T單克隆抗體作一抗，免疫組化檢測可見肝細胞核內(nèi)的棕色顆粒，證實SV40T

17、基因已整合入胚胎肝細胞（圖5A）. 另外該永生化胚胎肝細胞具備合成白蛋白的能力，免疫組化檢測可見胞漿內(nèi)有棕色顆粒著色（圖5B）.圖5免疫組織化學染色（略）3討論近年來在重型肝炎的治療方面已得到共識，即生物人工肝及肝細胞移植可以作為原位肝移植的有效替    代治療手段治療肝功能衰竭，而且取得了一定的臨床治療效果. 然而由于供肝短缺和原代肝細胞體外培養(yǎng)增殖困難，使得肝細胞材料的相關研究成為關注的熱點. 人們曾嘗試采用異種肝細胞或各種肝細胞系如C3A，HepG2來解決這一問題6-9，常用的豬肝細胞應用最為廣泛，效果也可靠，但異種肝細胞可引起強烈的免疫排斥反應，

18、而且由此帶來的人畜共患疾病的感染無法避免10. 采用C3A, HepG2的生物人工肝在動物實驗及部分臨床試驗中已取得肯定的結果，可是細胞系的來源為腫瘤細胞，研究顯示它的細胞色素P450酶活性、氨清除和尿素合成功能均較差，加之用于處于免疫抑制狀態(tài)的重型肝炎患者，潛在致瘤的風險始終令人擔憂11-12.我們利用真核表達載體pcDNA3.1，將猿猴病毒40大T抗原基因通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的原代胚胎肝細胞，經(jīng)G418篩選40 d后獲得一陽性細胞克隆. 生長曲線觀察結果表明，該細胞具有永生化細胞系典型的“S”特征，細胞生長的每一階段特征明顯. 光學顯微鏡下觀察，細胞呈典型的上皮細胞樣貼壁生長，細胞增殖

19、較快；透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞呈典型的肝細胞形態(tài)與結構，細胞核仁增大，胞內(nèi)含豐富的糖原顆粒，細胞極性恢復可見緊密連接和毛細膽管形成. 表明轉(zhuǎn)染肝細胞在形態(tài)結構上與原代細胞無明顯差異. 此外，我們構建的永生化胚胎肝細胞系的克隆形成能力較強，在軟瓊脂培養(yǎng)基中不能生長，而且核型組成與正常肝細胞相同，說明該細胞沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化. 經(jīng)免疫組織化學檢測，轉(zhuǎn)染肝細胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒，表明SV40T抗原已整合入胚胎肝細胞內(nèi)，另外人血白蛋白在細胞胞漿中有明確表達，說明該細胞系具備分泌蛋白的能力，具有正常肝細胞的某些功能.本研究結果表明，利用SV40T抗原，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法建立的這株永生化胚胎肝細胞系，具

20、備了原代肝細胞的典型形態(tài)特征以及某些生物學功能，為肝細胞體外長期培養(yǎng)以及功能維持提供了可能，應該可以成為生物人工肝及肝細胞移植研究中的理想細胞材料，從而為生物人工肝及肝細胞移植臨床的廣泛應用奠定更加堅實的基礎.【參考文獻】1 Di Campli C, Gasbarrini G, Gasbarrini A. A medicine based on cell transplantation is there a future for treating liver diseases?J. Aliment Pharmacol Ther, 2003, 18:473-480.2 Di Campli C, Nestola M, Piscaglia AC, et al. Cellbased therapy for liver diseasesJ. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2003, 7:41-44.3 Leckel K, Blaheta RA, Markus BH. State of hepatocyte transplantation:A risk or a chance? J. Zentralbl Chir, 2003