大黃蟲丸對肺纖維化模型形成階段肺組織TNF-α表達(dá)的影響

1、大黃蟲丸對肺纖維化模型形成階段肺組織TNF-表達(dá)的影響                           作者：李瑞琴，宋建平，李偉，張瑞，張麗敏，張現(xiàn)偉【摘要】  目的探討大黃蟲丸防治肺纖維化作用及機理。方法用平陽霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型后，第14天開始用藥組每天灌胃大黃蟲丸，第28天后處死各組大鼠，觀察、比較各組

2、大鼠肺部病理組織學(xué)改變及肺組織中腫瘤壞死因子（TNF-）表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠肺纖維化程度、肺組織中TNF-表達(dá)均明顯高于正常對照組及用藥組(P<0. 05)。結(jié)論大黃蟲丸能明顯減輕平陽霉素所致的大鼠肺纖維化程度，并能抑制肺組織中TNF-過度表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】  肺纖維化；腫瘤壞死因子；大黃蟲丸；大鼠       肺間質(zhì)纖維化是多種肺間質(zhì)疾病到晚期的一種常見病理變化。雖然導(dǎo)致肺纖維化的原因不同,但其病理變化都從肺泡炎開始。一般認(rèn)為肺纖維化改變是不可逆的, 西醫(yī)肺纖維化首選糖皮質(zhì)激素，但只有部分如非特異性間質(zhì)性肺炎（NSI

3、P）和脫屑性間質(zhì)性肺炎（DIP）等對激素反應(yīng)較好，另一方面長期大劑量應(yīng)用激素必將引起嚴(yán)重的代謝紊亂、免疫抑制和繼發(fā)感染等不良反應(yīng)，故防治肺纖維化藥物的研究日益成為國際肺界關(guān)注的熱點。近年來中藥治療肺纖維化報道較多，取得可喜成效，已被列入中華醫(yī)學(xué)會肺纖維化防治方案中。本實驗在有關(guān)和既往課題研究的基礎(chǔ)上, 觀察了大黃蟲丸對肺纖維化疾病模型的肺部病理損害和肺組織中腫瘤壞死因子(TNF-)表達(dá)的影響, 對肺纖維化的發(fā)病機制和大黃蟲丸對肺纖維化的干預(yù)機制進(jìn)行探討，為肺纖維化的中醫(yī)藥防治研究提供依據(jù)。1  材料與儀器1.1  動物普通級健康Wistar大鼠48只，雌性，體質(zhì)量18022

4、0 g，由河南省動物實驗中心提供，動物批號：0001432。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，室溫（22±2），相對濕度60%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，飲水量不限。1.2  主要藥物、試劑與儀器平陽霉素:天津太河制藥有限公司,批號07010203。大黃蟲丸:湖南九芝堂制藥廠,批號070602。潑尼松片:浙江仙琚制藥股份有限公司,批號:070608。兔抗人、鼠TNF-多克隆抗體：武漢博士德生物工程有限公司，產(chǎn)品編號：BA0431。即用型SABC免疫組化試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司, 產(chǎn)品編號SA1022。 DAB顯色試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司,產(chǎn)品編號ED1022。HPIA

5、S-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng):同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司。2  方法2.1 動物分組將動物隨機分為4組：正常對照組、模型對照組、大黃蟲丸組、潑尼松對照組，各組動物均為12只。2.2 動物造模與用藥本實驗選用大鼠氣管內(nèi)一次性注入平陽霉素復(fù)制肺纖維化模型1。除正常對照組正常飼養(yǎng)不作任何處理外，模型對照組及用藥組按文獻(xiàn)方法造模，以水合氯醛腹腔麻醉大鼠，取仰臥固定位，常規(guī)消毒，行頸正中切口，鈍型分離暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端穿刺注入平陽霉素生理鹽水溶液0.15 ml/100 g（平陽霉素3 mg/kg體質(zhì)量），立即將動物直立并行旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻，縫合皮膚，

6、待動物清醒后置籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。從造模后第14天開始，用藥組分別灌胃藥液1.5 ml/100 g體質(zhì)量，模型組灌入等量生理鹽水。每天給藥1次，每周復(fù)查動物體質(zhì)量以調(diào)整給藥量，各組于第28天處死。造模用藥平陽霉素按3 mg/kg進(jìn)行給藥,使用時用生理鹽水配制成2 mg/ml,按0.15 ml /100 g氣管內(nèi)給藥。其他藥物根據(jù)臨床常用藥量,參照動物與人體表面積折算系數(shù)動物每日用藥量大黃蟲丸1.2 g/kg,潑尼松片4 mg/kg體質(zhì)量,上述藥物使用時用蒸餾水配制。2.3  檢測方法2.3.1  觀察實驗動物一般情況體質(zhì)量、飲食、皮毛、活動狀況等。2.3.2  肺臟形態(tài)

7、學(xué)觀察實驗結(jié)束時稱取動物體質(zhì)量，腹主動脈取血處死動物,完整摘取肺臟,肉眼觀察臟器病變情況。2.3.3  肺臟病理組織學(xué)檢查取右肺下葉固定、脫水、包埋、切片,分別進(jìn)行HE、VG染色和免疫組織化學(xué)檢查。對HE、VG染色的切片參照文獻(xiàn)2將肺泡炎或肺纖維化程度分級: 0級無肺泡炎或無纖維化;級:輕度肺泡炎或纖維化,受累面積少于全肺的20%;級:中度肺泡炎或纖維化,受累面積20%50%;級:重度肺泡炎或纖維化,受累面積>50%。2.3.4   肺組織TNF-檢測采用免疫組織化學(xué)法。用HPIAS-1000計算機圖象分析系統(tǒng)對染色后的切片進(jìn)行定量分析，計算每張切片陽性細(xì)胞

8、染色程度，免疫組化切片以細(xì)胞胞漿中呈清晰棕黃色為陽性。在高倍鏡下觀察，隨機選上、下、左、右、中央5個視野，測量目標(biāo)區(qū)域的平均光密度。2.4  統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，所用的統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P值小于0.05將被認(rèn)為所檢驗的差別有統(tǒng)計意義。對服從正態(tài)分布的組間計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異性判斷采用單因素方差分析，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Dunnett T3檢驗，肺纖維化程度為等級計數(shù)資料，采用Radit分析，以R值表示，組間R值的顯著性檢驗采用t檢驗。3  結(jié)果3.1  一般情況正常對照組大鼠活潑好動

9、，強壯肥碩，皮毛光滑，體重逐漸增加，呼吸平穩(wěn)；模型對照組精神不振，行動遲緩，拱背蜷縮，皮毛干枯稀疏、無光澤、多見倒豎現(xiàn)象，身體較其它組消瘦，呼吸急促；潑尼松對照組開始尚可，后期出現(xiàn)皮毛干枯，反應(yīng)遲鈍，活動及飲食均減少，部分體重下降；大黃蟲丸組皮毛尚可，身體較壯，飲食較正常。3.2 肺組織病檢查3.2.1  肺整體形態(tài)觀察正常對照組肺外觀無明顯異常，呈粉紅色，表面光滑；模型對照組表面凹凸不平，呈暗紅色，邊緣有點狀出血，部分肺葉體積縮小，表面有大小不等的灰白色結(jié)節(jié)。大部分動物肺臟體積縮小，彈性明顯降低，表面條索狀凹溝。組間比較，潑尼松對照組與大黃蟲丸組雙肺色澤、體積、硬度、彈性、結(jié)節(jié)樣改

10、變等情況有所好轉(zhuǎn)，兩肺顏色略暗紅，雙肺表面較模型對照組光滑，大部分動物肺臟彈性尚可，部分肺葉偶爾可見散在的點狀灰白色斑塊。1         3.2.2 肺組織光鏡下病理檢查正常對照組大鼠肺結(jié)構(gòu)清晰，支氣管、肺泡及肺泡間隔組織結(jié)構(gòu)正常，無充血、水腫及急慢性炎癥等改變，各觀察點均未出現(xiàn)明顯病理改變。模型對照組肺泡間隔明顯增寬，成纖維細(xì)胞增生，膠原基質(zhì)明顯增多，炎性細(xì)胞浸潤；肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡腔消失、萎縮，肺泡壁顯著增厚、斷裂，肺纖維化病變等級多為級。表明動物模型復(fù)制是成功的。潑尼松對照組、大黃蟲丸組與模型組比較，

11、病理變化基本相似，但程度較輕，以肺纖維化病變?yōu)橹?，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺纖維化瘢痕形成，毛細(xì)血管管腔閉塞。潑尼松對照組病變程度較大黃蟲丸組嚴(yán)重。肺纖維化程度經(jīng)Radit分析，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），纖維化程度由重到輕為：模型對照組潑尼松對照組大黃蟲丸組正常對照組（結(jié)果見表1）。表1  第28天肺纖維化程度比較（略）組別肺纖維化（第28天）  0級級級 R值正常對照 1200 03.2.3  各組肺組織中TNF-的表達(dá)TNF-蛋白表達(dá)主要定位于肺泡巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及細(xì)支氣管上皮下組織以及肺間質(zhì)、血管平滑肌細(xì)

12、胞中。TNF-蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色細(xì)顆粒狀，或呈棕黃色絲網(wǎng)狀，其表達(dá)越強，棕黃色細(xì)顆粒越多。    鏡下觀察肺組織免疫組化結(jié)果：正常肺組織切片可見少許陽性棕黃色產(chǎn)物分布。各組TNF-的平均光密度值從高到低為：模型對照組>潑尼松對照組>大黃蟲丸組>正常對照組。模型對照組平均光密度值顯著高于正常對照組（P<0.05）；各用藥組的平均光密度值均顯著低于模型對照組（P<0.05）；大黃蟲丸組與潑尼松對照組比較有顯著差異（P<0.05）。結(jié)果見表2。表2  第28天各組肺組織TNF-表達(dá)比較（略）4  討論目前西醫(yī)肺纖

13、維化首選糖皮質(zhì)激素,但僅對部分病人有效,另一方面,應(yīng)用激素可引起嚴(yán)重的代謝紊亂、免疫抑制、繼發(fā)感染等副作用。近年來中醫(yī)藥防治肺纖維化顯示出良好的前景,活血化瘀、補肺益腎、化痰通絡(luò)等治法與方藥證實對肺纖維化形成有預(yù)防和治療效果35。但對中醫(yī)藥防治肺纖維化的機制尚無統(tǒng)一認(rèn)識。    肺纖維化多由于肺泡上皮結(jié)構(gòu)和功能損傷，導(dǎo)致上皮基底膜裸出和斷裂，激活的成纖維細(xì)胞從斷裂的基底膜中間侵入肺泡腔內(nèi)，粘附在肺泡腔內(nèi)開始增殖，并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，分泌纖維粘蛋白、蛋白多糖和膠原等纖維成分，形成肺泡和間質(zhì)一體化的纖維化6，細(xì)胞因子在肺纖維化的發(fā)生、過程中起著重要作用，尤其是肺內(nèi)多

14、處持續(xù)進(jìn)展的微小肺泡上皮損傷后產(chǎn)生細(xì)胞因子，其中TNF-、TGF-、PDGF、IL-1、內(nèi)皮素1（ET-1）、核蛋白中核因子（JBNF-JB）等與肺纖維化關(guān)系密切。TNF-、IL-1是導(dǎo)致肺纖維化較關(guān)鍵的細(xì)胞因子，參與肺纖維化組織局部損傷與炎癥反應(yīng)。TNF-是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，與肺纖維化和間質(zhì)性炎癥有關(guān)，靜脈注射TNF-可引起彌漫性肺泡損傷，以肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞壞死為主要表現(xiàn)。它可增加中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的功能，并刺激其產(chǎn)生超氧化物，釋放溶酶體酶，對其周圍組織細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，它還可介導(dǎo)其他細(xì)胞因子和炎癥因子的表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖并分泌大量的膠原7。

15、TNF-在肺纖維化的發(fā)展過程中起雙重作用8。內(nèi)源性TNF-的過量表達(dá)能促進(jìn)肺纖維化的形成；而外源性的TNF-則可通過減少I型受體或增加前列腺素E2的分泌而抑制肺纖維化的形成。    研究912，肺纖維化的病機包括氣虛、陰虛、血淤、痰濁等，一般早中期多實，大致包括瘀血阻滯、痰瘀互結(jié)、痰濁痹阻、風(fēng)濕痹阻等，但也有報道早期可出現(xiàn)肺腎兩虛9，晚期多虛，包括肺陰虧虛、肺氣虧虛、腎氣虧虛、肺腎兩虛、氣陰兩虛，也有因?qū)嵦撓嗷ビ绊懗霈F(xiàn)虛實夾雜。大黃蟲丸適應(yīng)的淤血阻滯病機可見于肺纖維化臨床病人。大黃蟲丸是金匱要略中治療虛勞挾瘀的代表方，長于緩消瘀血，多用于久病血淤。虛勞挾瘀是正虛與

16、瘀血并存之證，臨床表現(xiàn)與肺纖維化后期表現(xiàn)相似。文獻(xiàn)報道大黃蟲丸能較好地減輕肝臟免疫性損傷，抑制纖維增生，防止肝纖維化13。大黃蟲丸對肺纖維化動物模型初期階段（7天）有一定的防治作用。    本研究提示大黃蟲丸具有減輕肺纖維化模型形成階段肺部病理改變的作用，大黃蟲丸具有顯著抑制肺組織中TNF-表達(dá)的作用，這可能是其減輕肺纖維化模型形成階段肺部病理損害作用機制之一?！疚墨I(xiàn)】  1Snider GL,Celia BR,Goldstein RH,et al.chronic interstitial pulmonary fibrosis produced in h

17、amster by endotracheal bleomycinJ.Am Rev Respire Ids, 1978,1179(2):289.2何冰，趙桂榮，劉新民，等，白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑對肺間質(zhì)纖維化的影響J.中華結(jié)核與呼吸雜志，1994，17（1）：21.3孔祥文.特發(fā)性肺纖維化的中醫(yī)治療J.中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，12（1）：67.4彭玉華.特發(fā)性肺纖維化中醫(yī)藥治療思路與方法J.中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21(10)：1774.5李青，郭光業(yè),張國瑛,等.固金湯對實驗性肺纖維化的防治作用研究J.中華中醫(yī)藥雜志,2006，21(1):58.6孫鐵英，林嘉濱，張洪勝，等48例慢性肺間質(zhì)疾

18、病臨床特征分析及肺功能分析J北京醫(yī)學(xué)，2002，24（4）：232.7Piquet PF,Collart MA,Grau GE,et al.Tumor necrosis factor/cachecctin plays a key role in bleomycin-induced pneumopathy and fibrosisJ.J Exp Med,1989,170：655.8Fu jit a M, Shannon JM, M orikawa O, et al. Overexpression Of tumor necrosis factor2-lpha diminishes pulmonary fibrosis Induced by bleomycin or transforming growth factor-betaJ. Am J R